This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO•) probes (geNOps) to monitor single cell NO• fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO• formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.
一酸化窒素は、(•NO)、哺乳動物、細菌や植物に複数の重要な細胞機能を媒介する、小型の基です。 インビボおよびインビトロで NO•を検出するための多数の方法が存在するにもかかわらず、単一細胞レベルでのNO•のリアルタイム監視が非常に困難です。 NO•の生理学的または病理学的影響は、実際の濃度によって決定され、このラジカルの滞留時間をされています。したがって、NO•の単一細胞の検出を可能にする方法が非常に望ましいです。最近、我々は直接それゆえ、このニーズに対応し、携帯NO•変動に対応し、単一の蛍光タンパク質ベースの遺伝的にコードされた一酸化窒素(•NO)プローブ(geNOps)を導入することによってNO•指標のパレットを拡大しました。ここでは、NO•二つの異なる化学-liberating分子に応答して細胞内NO•信号を評価するgeNOpsの使用法を示します。我々の結果のALSO新たに調製した3-(2-ヒドロキシ-1-メチル-2- nitrosohydrazino)-N-メチル-1-プロパンアミン(NOC-7)と比較して、細胞内のNO•レベルの変化を誘発するための非常に高い可能性を秘めていることを確認します無機NO•ドナーニトロプルシドナトリウム(SNP)。さらに、緑色geNOps(G-geNOp)を用いて、二色生細胞イメージングおよび化学の Ca 2+インジケーターフラ-2は、単一の内皮細胞中のCa 2+依存性NO•形成の厳しい規制を視覚化するために行きました。これらの代表的な実験はgeNOps、多様な実験的なセットアップに単細胞NO•信号のリアルタイムの生成および分解を研究するのに適したツールであることを示しています。
我々は最近、1 geNOpsと呼ばれる、遺伝的に符号化された蛍光NO•プローブの新規クラスを開発しました。これらのセンサは、異なる蛍光タンパク質(FP)バリアント3(シアン、緑またはオレンジFP)にコンジュゲートしているだけで構築された、細菌由来、NO•結合ドメイン2、で構成されています。 NO geNOps内の非ヘム鉄(II)センタ4への結合•瞬時に蛍光強度1を低減します。細胞内のNO•レベル1を辞退するとき重要なのは、geNOps蛍光を迅速かつ完全に回復します。したがって、geNOpsは(サブ)携帯NO•変動のリアルタイムイメージングを可能にします。 geNOpsのNO•センシング機構は、これまで不明であるが、それらは優れたNO•記者であってもよく、ひいては多色、定量NO。•bioimaginの新時代を開くために効力を有することが証明されています高い空間と時間分解能1とグラム、5。他の利用可能な蛍光NO。•プローブは、細胞内にロードする必要がある小さな化学化合物、に基づいており、そして不可逆的NO•6によって修飾されます。 NO•敏感な小フルオロフォアの追加の欠点は、それが困難な、信頼性の高い分析と決定的な方法7、8、9でそれらを使用することを可能にする彼らの潜在的な細胞毒性および比較的低い特異性です。遺伝的にコード化された蛍光プローブの有効利用が効率的な遺伝子導入技術を必要とするが、FPベースの遺伝的にコードされたセンサは、細胞10、11の内部機能の我々の理解に革命をもたらしている必要不可欠なツールとして浮上しています。シングルFP-ベースgeNOps、Fの開発の前にörster共鳴エネルギー移動(FRET)、NO•センサベースないNOA-1 12は 、構築されたと呼ばれます。佐藤ら。 NO•感受性可溶性グアニル酸シクラーゼ(sGC)の二つのサブユニット、環状グアノシン一リン酸(cGMP)レベル12を報告共役するFRETベースのセンサの両方で構成され、この洗練されたプローブを設計しました。このプローブはcGMPのに応答するように、それは間接的にしか細胞内NO•変動12を感知します 。 NOA-1は、ナノモル範囲のNO•上昇に応答しますが、このツールは、おそらくこのかさばる二部センサーの可用性と実用性に関する制限のために、これまで頻繁に使用されていません。
基本的な生物学的プロセスはよく13、14を特徴づけてきたインパクトNO•、の多彩な機能。多くの研究は、NO•concentratioことを証明しましたn個のセルとサブドメイン内の健康と病気14、15、16で細胞の運命を決定します。哺乳動物では、NO•主によく特徴付け一酸化窒素合成酵素(NOS)ファミリー17によって種々の細胞型に酵素的に生成されます。これまで、NOSの3つのアイソフォームは、18、19、20に記載されています。これらは、Ca 2+ /カルモジュリン依存性内皮NOS(eNOSのまたはNOS-3)18およびニューロンNOS(のnNOSまたはNOS-1)19、およびCa 2+ /カルモジュリン依存しない恒常的に活性誘導型NOS(iNOSのかnoso-の異形です2)20。また、ミトコンドリアNOS(mtNOS)の存在も21示唆されています。しかし、mtNOSはのnNOSのスプライシングバリアントと考えられているので、別々に分類されていませんアイソフォーム21として。他のアイソフォームは、離れた哺乳動物細胞のものと、いわゆる細菌NOS(bNOS)は、主にグラム陽性菌22に見出されます。 NO•の酵素の生産は高度に制御し、アデニンジヌクレオチド(FAD)、テトラヒドロビオプテリン(BH4)、分子状酸素およびL-アルギニン17フラビン 、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)などのいくつかの補因子の利用可能性に依存します。カチオン性アミノ酸L-アルギニンは、NO•産17時L-シトルリンに変換する基板です。 NO•の高度に調節された酵素の生成に加えて、ラジカルは、低酸素条件下23の下でのミトコンドリアによって亜硝酸塩プールから非酵素的に低減することができると仮定されています。 NO•が細胞内で生成されると、それは自由に生体膜14を通って拡散することができ、refは"> 15。しかし、この基の非常に短い半減期は、主に、環境条件によって決定され、そして種々の経路との化学反応を効率的にNO•レベル24を劣化させる。最終的に、NO•の生成、拡散、および分解が依存します高度に生物学的に活性な分子24の有効濃度を決定する多様な環境パラメータに。
geNOps技術は、(サブ)の細胞のNO•変動1の直接検出を可能にし、再調査することが適しており、新たに携帯NO•信号の蓄積と分解のための責任のメカニズムを発見します。ここでは、個々の細胞のレベルでは、単純なプロトコルおよび外因的に誘発された可視化するgeNOpsの使用のための代表的な結果と内因的に生成されたNO•プロファイルを提供しています。また、geNOps技術は、APに適合させることができます多様な細胞の刺激やストレスに応答してNO•形成、拡散、及び分解の複雑なパターンを研究する他の細胞モデル系で襞。
生物学28における重要なシグナル伝達分子としてのNO•の発見以来、可能かつ確実に高解像度の単一の細胞、組織および動物全体におけるラジカルの特定のリアルタイム測定が望まれています。ここでは、広視野蛍光顕微鏡1を使用して、正確なNO•信号のライブセルイメージングを可能にする最近開発された遺伝的にコードされた蛍光のNO•プローブ(geNOps)の適用を報告しています。
安定した緑色蛍光G-geNOpを発現精巧かつ侵襲的なトランスフェクション手順を回避するHEK細胞クローンは、外因生成単細胞NO•プロファイルを定量しました。 HEK細胞は、通常、NOを•内因29産生しないように、この細胞型は、共培養条件の多くの他の用途に有用であるかもしれないgeNOpベースセンサー細胞株の生成に適していますNOと•初代細胞、あるいは動物30生き中を生産します。しかし、本研究では、HEK細胞モデルを表現するG-geNOpを用いた細胞内NO•信号を喚起するために、異なる濃度および安定性の化合物を、-liberating様々なNO•の能力を実証します。我々のデータは、アプリケーションのNO•-donor濃度、品質及び方法は、最終的には細胞内のNO•プロファイルのパターンを決定することを明らかにしました。このような情報は、いくつかの疾患の指標である異なるNO•ドナーのその場での薬物動態学的特性評価のために不可欠です。特に、geNOpsは安定して非常に長い時間1上に NO•-donorパルスの複数の反復的なアプリケーションに対応することが示されています。したがって、本明細書に示される化合物を-liberating•NOを用いた実験では、それぞれの細胞のNOの様々な振幅と動態に関する半定量的結論を可能にします226;信号( 図1及び2)。
安定に発現するHEK細胞クローンは、おそらく単一の細胞に由来するが、G-geNOps発現レベルの広範な不均一性は、( 図1)が観察されました。これは、関心のある(ゲノム統合)遺伝子の転写は、細胞増殖速度32に影響を与える多様な環境ストレス31として多くの因子の制御下にあるように、安定な細胞クローンの一般的特徴であり、細胞周期の状態33。シングルFP-ベースgeNOpsは、したがって、NO•はgeNOp発現レベル1と蛍光強度が増加の損失を誘発、非レシオメトリックプローブであると。したがって、geNOps信号の正規化は、特に、比較分析の場合には携帯NO•信号を定量化するために不可欠です。我々の最近の研究では、厳密な線形相関(b)に示すように、etween geNOpsの基底蛍光強度と蛍光強度の広い範囲にわたってNO•誘導性の蛍光消光の強度は1を発見されました。これは、細胞のNO•信号の絶対定量化のためのgeNOpsの重要な特徴です。 図1に示すように 、NOC-7およびSNPに応答したG-geNOps信号の正規化は、HEK細胞が取り込む能力に関してで多様されていないことを示す、同じプレートから別のHEK細胞に均質NO•信号を明らかにしましたそして、NO•ドナー由来するラジカル•NOを劣化させます。これとは対照的に、HeLa細胞中で使用してgeNOpsは、NOC-7に対応して異なる細胞間の細胞NO•信号の明確な不均質性を実証しました。これらの違いは、細胞生理学および病理学における複数の意味を持っているかもしれない、とgeNOpを使用して明らかにすることができる、細胞型特異的NO•代謝や分解速度を指しますsの技術。
それにもかかわらず、geNOpsの2つの重要な機能は、センサーとデータ解釈の正しい使用方法については慎重に検討する必要があります:ⅰ)geNOpsはgeNOpsことができ、完全にFPバリアントに応じてNO•1に対応し、ii)のために十分な鉄(II)が必要ですpH感受性1です。ここでは、HEK、HeLa細胞またはEA.hy926細胞(プロトコル2.6を参照)のいずれかで表されgeNOpsの無毒鉄(II)補充のために適切であることが見出されているプロトコルを記述する。それは鉄と細胞処理は(II)/ビタミンCは、細胞形態、細胞生存率および細胞1の代謝活性に影響を及ぼさなかったことが実証されているが、他の細胞型および組織のためのこの重要なステップを最適化するために不可欠であるかもしれません。しかし、いくつかの実験条件では、鉄(II)の負荷の要件はgeNOpsの適用が制限される場合があります。注目すべきは、アスコルビン酸は、Nを減少させることができることが示されています•O 35とアスコルビン酸-鉄(II)錯体は、NO•36、37を捕捉することができます。また、過剰な鉄(II)およびアスコルビン酸は、炎症応答39と脱共役eNOSの41を誘導することができます。このような効果はgeNOps技術を使用する場合に考慮する必要があります。特定の実験条件下で、細胞内pHがgeNOps蛍光1に影響を与える可能性を有する、34著しく影響されることが示されています。特に、シアン、緑geNOps変異体は、比較的pHを酸性化1時の蛍光の減少を示す敏感です。 pH感受性geNOpsを使用しているときしたがって、(サブ)の細胞のpHの急性変化は、偽のNO•信号をシミュレートすることがあります。負の制御として私たちの前の仕事、NO•小文字を区別しないgeNOps(geNOpsのMUT)の並列使用で示唆したようにlsコマンドは、pHが1を変更するから、実際の携帯NO•信号を分析することをお勧めします。加えて、細胞のpHの変化は、削ぎ接ぎする34等のpHプローブを用いて検査することができます。
さらに、我々は、内皮細胞代理EA.hy926で生理のCa 2+ -mobilizingアゴニストに応答して、内因性酵素NO•形成を可視化しました。 EA.hy926細胞株は、一貫してeNOSの38発現頻繁に使用されるモデル系です。一過EA.hy926細胞で発現geNOpsの使用は、IP 3は、Ca 2+シグナルはほぼ完全にL-NNAによってブロックされた、この細胞型に深いNO•形成を引き起こす媒介することを確認しました。一時的にNO•信号との Ca 2+を相関させるためには、G-geNOp発現細胞は、UV励起性化学のCa 2+ -indicatorフラ-2 / AMを負荷しました。 Ca 2+結合および非結合フラ-2のfluoのスペクトル分離市販のフィルタ40を設定してG-geNOp信号からrescenceを容易に実現することができます。イメージングプローブの両方は、Ca 2+ -triggered酵素NO•形成がこの内皮細胞型における細胞質ゾルのCa 2+の上昇に比べてはるかに遅く発生することを発表しました。 IP 3発生アゴニストブラジキニン、ならびにせん断応力を用いた細胞治療の際にウシ肺動脈からの内皮細胞における単一細胞NO•信号の同様の動態は、NOA-1、間接性の高いNO•感受性センサー12を用いて報告されています。したがって、これらのデータは、Ca 2+完全な酵素活性に到達するまでのeNOS由来NO•形成は、特定の開始時間を必要-evokedことを強調する。携帯NO•形成の速度は、拡散や劣化が他のデータから抽出することができますが、NO•の例えばテンションベースの測定は、血管弛緩を誘発しましたSS = "外部参照"> 26、蛍光のNO•プローブの大きな利点は、彼らが直接、リアルタイムに可視信号に携帯NO•変動を変換することです。したがって、geNOps付き携帯NO•信号を画像化することは、高い空間分解能と時間分解能を提供し、(サブ)携帯NO•ホメオスタシスを調査(再)にユニークな可能性を提供しています。例えば、単一の内皮細胞にgeNOps技術との組み合わせで42を往復イメージングのeNOSはNO•産生酵素またはそのようなカルモジュリンおよびカベオリン43などの他の関連するタンパク質の細胞内局在や転座でNO•形成を相関するのに適している可能性があります。
ここでは、従来の広視野蛍光mに単一細胞レベルで、リアルタイムでHEKとEA.hy926細胞外因を可視化すると、体内で産生させるセルラーNO•信号を発現しているG-geNOpの実用的なアプリケーションを記述するicroscope。我々のデータはgeNOpsが特に興味深いの細胞型のすべての種類を使用して、種々の実験条件下での(サブ)セルラNO•ダイナミクスを追跡するのに適していることを意味します。
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge C.J. Edgell, Pathology Department, University of North Carolina at Chapel Hill, NC, USA for providing the EA.hy926 cells. Author E.E. is supported by Nikon Austria within the Nikon-Center of Excellence, Graz and is a fellow of the Ph.D. program in Molecular Medicine at the Medical University of Graz. The researchers are also supported by the Ph.D. program Metabolic and Cardiovascular Disease (DK-W1226) of the Medical University of Graz. This work was also funded by the FWF project P 28529-B27. Microscopic equipment is part of the Nikon-Center of Excellence, Graz that is supported by the Austrian infrastructure program 2013/2014, Nikon Austria Inc., and BioTechMed, Graz.
NaCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.20 | sodium chloride |
KCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6781.1 | potassium chloride |
CaCl2 .2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T885.1 | calcium chloride dihydrate |
MgCl2 .6H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2189.2 | magnesium chloride hexahydrate |
HEPES | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 9105.3 | 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
NaHCO3 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8551.1 | sodium hydrogencarbonate |
KH2PO4 | Merck, Darmstadt, Germany | 104873 | potassium dihydrogen phosphate |
Na2HPO4 .2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4984.1 | sodium hydrogenphosphate dihydrate |
D(+)-Glucose monohydrate | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6780.1 | >99.5%; for cell culture, endotoxin free; |
EGTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3054.2 | ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid; calcium chelating agent |
NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6771.1 | sodium hydroxide |
HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4625.1 | hydrochloric acid, fuming, 37% (~10 N) |
DMSO | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4720.1 | dimethyl sulfoxide; highly polar, aprotic organic solvent |
L-Glutamic acid hydrochloride | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | G2128 | (S)-2-Aminoglutaric acid |
DMEM, low glucose | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | D5523 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose; with 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
MEM Vitamin solution (100X) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11120037 | 100x the vitamins found in the standard Minimum Essential Medium (MEM) |
MEM Amino acids solution (50X) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11130036 | 50X the essential amino acids (except L-glutamine) found in the standard Minimum Essential Medium (MEM) |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15140122.00 | antibiotics to prevent bacterial contamination of cell cultures |
Amphotericin B | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15290026.00 | Gibco Amphotericin B contains 250 µg of amphotericin B (Fungizone) and 205 µg of sodium deoxycholate; prevents the contamination of cell cultures by yeast and multicellular fungi |
FCS | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270106 | Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin |
PBS, pH 7.4 | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010031.00 | phosphate-buffered saline |
Fura-2 (AM) | Teflabs, Austin, TX, USA | 102 | fluorescent cytosolic calcium indicators |
Histamine dihydrochlorid | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | H7250 | 2-(4-Imidazolyl)ethylamine dihydrochloride; IP3-generating agonist |
Nω-Nitro-L-arginine | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | N5501 | N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoic acid; L-NNA; inhibitor of nitric oxide synthase |
NOC-7 | Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany | 487952 | 3-(2-Hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine; nitric oxide (NO) donor short half-life of NO release |
Sodium nitroprusside dihydrate | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-203395A | sodium nitroferricyanide(III) dihydrate; nitric oxide releasing compound |
30-mm Cover slips | Karl Hecht, Sondheim v. d. Rhön, Germany | 41001130 | glass cover slips, HECHT "Assistent", size 1, round, 30-mm, (VE: 100 pcs.) |
Iron(II) booster solution | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | Iron(II) containing physiological buffer for non toxic iron(II) loading of cells; http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/ |
G-geNOp plasmid | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | plasmid DNA encoding green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product/g-genop/ |
G-geNOp AAV5 | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | adenovirus encoding green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/ |
G-geNOp sensor cell line | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | human embryonic kidney cell line (HEK293) stably expressing green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/ |
HEK293A cell line | Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R70507 | subclone of human embryonic kidney cell line (HEK293) |
EA.hy926 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Germany | CRL-2922 | somatic cell hybrid clone of human umbilical vein cell line with a thioguanine-resistant clone of A549 |
TILL iMIC | Till Photonics, Graefling, Germany | n.a. | digital microscope |
Polychrome V monochromator | Till Photonics, Graefling, Germany | n.a. | ultra fast switching |
AVT Stingray F145B | Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany | n.a. | Versatile CCD camera with Sony ICX285 EXview HAD sensor, IEEE 1394b |
alpha Plan Fluar 40 | Zeiss, Göttingen, Germany | n.a. | x40 objective |
dichroic filters | Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, USA | n.a. | GFP emitter 514/3 nm (515dcxr) |
ValveBank8 Controller | AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, California, USA | 01-08 | programmable perfusion system control unit |
BVC control | Vacuubrand, Wertheim, Germany | 727200 | Chemistry diaphragm pump ME 1C; vacuum pump for perfusion system |
ImageJ software | NIH Image | Java image processing program inspired by NIH Image. http://imagej.net/Welcome |