A imagem em células vivas das células sanguíneas marcadas na circulação ocular pode fornecer informações sobre inflamação e isquemia na retinopatia diabética e degeneração macular relacionada à idade. É descrito um protocolo para rotular as células do sangue e imagem das células rotuladas na circulação da retina.
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Artigo de método
Etiquetagem de corantes fluorescentes de eritrócitos e leucócitos para estudar a dinâmica do fluxo na circulação da retina do mouse
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A dinâmica da corrente retiniana e coroidal pode fornecer informações sobre a fisiopatologia e seqüelas de várias doenças oculares, como glaucoma, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade (AMD) e outras condições inflamatórias oculares. Também pode ajudar a monitorar as respostas terapêuticas no olho. A rotulagem adequada das células do sangue, juntamente com imagens de células vivas das células rotuladas, permite a investigação da dinâmica do fluxo na circulação retiniana e coróide. Aqui, descrevemos os protocolos padronizados de 1,5% de indocyanina verde (ICG) e 1% de marcação de fluoresceína de sódio de ratos eritrócitos e leucócitos, respectivamente. Foi aplicada a oftalmoscopia laser de varredura (SLO) para visualizar as células rotuladas na circulação da retina de camundongos C57BL / 6J (tipo selvagem). Ambos os métodos demonstraram células distintas marcadas fluorescentemente na circulação da retina do mouse. Estes métodos de rotulagem podem ter aplicações mais amplas em várias doenças ocularesModelos.
Introdução
Estudar a dinâmica do fluxo das células sanguíneas na circulação retiniana e coróide é imperativo para a compreensão da patogênese de doenças oculares potencialmente ameaçadoras de visão e outras condições inflamatórias oculares. No entanto, as técnicas de angiografia convencional, que envolvem a ligação de corantes fluorescentes a proteínas plasmáticas, não fornecem nenhuma informação sobre a dinâmica dos eritrócitos ou leucócitos 1 . A dinâmica do fluxo da retina dos eritrócitos é importante para estudar a circulação metabolicamente eficiente na retina e a dinâmica do fluxo de leucócitos, para entender a migração celular, reconhecimento, ade....
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Protocolo
Os protocolos de animais utilizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal de SingHealth, em Cingapura e estão de acordo com as diretrizes da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) Declaração para o Uso de Animais em Oftálmica e Visão Pesquisa.
1. Rotulagem de eritrócitos e leucócitos com corantes fluorescentes
- Preparação de reagentes
- Prepare ICG (1,5 mg / mL) dissolvendo 3 mg de ICG em 1800 μL de água destilada esterilizada. Adicione 200 μL de solução salina tamponada com fosfato 10x (PBS).
- Preparar 40% 1x PBS adicionando 4 mL de 1x PBS a 6 mL de água desti....
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Resultados
Os eritrócitos marcados com ICG a 1,5% foram visualizados na circulação da retina de ratinhos C57BL / 6J (tipo selvagem). Tanto o hematócrito de 1% como o de 5% de eritrócitos marcados com ICG a 1,5% foram distinguíveis na circulação da retina. No entanto, as células rotuladas individuais foram mais claramente visualizadas com 1% de hematócrito de 1,5% de eritrócitos marcados com ICG ( Figura 1 ). Em 5% de hematócrito, devido ao grande número de células marc.......
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Discussão
Estudar a hemodinâmica na circulação retiniana e coróide é vital para a compreensão da fisiopatologia de muitas doenças oculares. A dinâmica do fluxo sanguíneo na circulação da retina pode ser estudada por tomografia de coerência óptica de domínio de Fourier (FD-OCT), fluxografia de speckle laser (LSFG) e oximetria retiniana. Embora estes métodos utilizem diferentes abordagens para estudar o fluxo sanguíneo total na circulação da retina 40 , 41 ,
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar. Não há conflito financeiro ou financeiro.
Agradecimentos
O projeto de pesquisa foi financiado pela bolsa do New Investigator do National Medical Research Council (NMRC), em Cingapura. A equipe gostaria de reconhecer o treinamento de pesquisa fornecido ao Dr. Agrawal no Instituto de Oftalmologia (IOO), University College London (UCL) sob a Associação de Treinamento de Pesquisa no Exterior do National Research Research (NMRC) de novembro de 2012 a outubro de 2014 sob orientação do Prof. David Shima. O Dr. Agrawal adquiriu o conceito e habilidades para rotular as células e imagens em vivo no laboratório do Dr. Shima. Por conseguinte, a equipe gostaria de reconhecer supervisão e orientação durante a bolsa de treinamento do Pro....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Corante de polimetina Cardiogreen (verde de indocianina) | Sigma Aldrich | 12633-50MG | |
| Fluoresceína 100 mg / mL | Novartis | U1705A / H-1330292 | |
| 10x solução salina tamponada com fosfato (PBS) Ultra Pure Grade | 1ª BASE | BUF-2040-10X1L | |
| Albumina de soro bovino | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Tubos Microtainer com K2E (K2EDTA) - concentração de EDTA - 1,8 mg/mL de sangue | BD, EUA | REF | |
| Solução Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |
| Centrífuga 5810 R | Eppendorf | 05-413-401 | |
| Tubos de microcentrífuga 2 mL | Axygen | MCT-200-C-S | |
| Misturador de vórtice | Insta BioAnalytik pte. ltd | VÓRTICE | |
| Incubadora | Shaker Lab Tech | ||
| Ceva Injeção de cetamina (Cloridrato de cetamina 100 mg/mL) | Ceva | KETALAB03 | |
| ILIUM XYLAZIL-20 (Cloridrato de xilazina 20 mg/Ml) | Troy Laboratories PTY. Limited | LI0605 | |
| 1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamida 1%) | Alcon Laboratories, Inc. EUA | NDC 0998-0355-15 | |
| 2,5% Mydfrin 5 mL (Cloridrato de fenilefrina 2,5%) | Alcon Laboratories, Inc. EUA | NDC 0998-0342-05 | |
| Seringa Terumo com agulha 1 cc/mL Tuberculina | Terumo (Filipinas) Corporation, Filipinas | SS-01T2613 | |
| Gel Vidisic 10 G | Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlim, Alemanha | ||
| Cotonetes com álcool | Assegure descartáveis médicos | 7M-004-L-01 | |
| Sistema confocal de angiografia por varredura a laser (Heidelberg Retina Angiograph 2) | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Alemanha | ||
| Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Alemanha | ||
| Microscópio fluorescente | ZEISS | Modelo: axio imager z1 |
Referências
- Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent vesicle system. A new technique for measuring blood flow in the retina. Ophthalmology. 101 (10), 1716-1726 (1994).
- Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent lab....
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Reimpressões e permissões
