This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.
पिछले दशक के दौरान, चैनलरहादोपिस तंत्रिका विज्ञान के अनुसंधान में अपरिहार्य बन गए थे, जहां लक्ष्य कोशिकाओं में विद्युत प्रक्रियाओं में गैर-इनवेस्टीज से हेरफेर करने के लिए उन्हें उपकरण के रूप में उपयोग किया जाता है। इस संदर्भ में, चैनलरहादोपसिन की आयन की चुनिंदा विशेष महत्व है। यह लेख एचईके 2 9 3 कोशिकाओं पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के माध्यम से प्रोमोमिनस सल्काटा के एक हाल ही में पहचान किए गए आयनों-संचालन चैनलरहादोपसिन के लिए क्लोराइड चयनात्मकता की जांच का वर्णन करता है। हल्के गेट वाले फोटोक्र्रेनों को मापने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया तेजी से स्विच करने की मांग करती है – आदर्श रूप से मोनोक्रैमैटिक-प्रकाश स्रोत जो अन्यथा पारंपरिक पैच-दबाना सेटअप के माइक्रोस्कोप में जुड़ा हुआ है। प्रयोग से पहले की तैयारी प्रक्रियाओं को बफर किए गए समाधान की तैयारी, तरल जंक्शन क्षमता पर विचार, बीज लगाने और कोशिकाओं के अभिकर्मक, और पैचिपिपेट्स खींचने में शामिल किया गया है। वर्तमान-वोल्टेज संबंध की वास्तविक रिकॉर्डिंगएस अलग-अलग क्लोराइड सांद्रता के लिए प्रतिवर्ती क्षमता निर्धारित करने के लिए अभिकर्मक के बाद 24 घंटे से 48 घंटे लगते हैं। अंत में, क्लोराइड प्रवाहकत्त्व के सैद्धांतिक विचारों के संबंध में इलेक्ट्रोफिजिकल डेटा का विश्लेषण किया जाता है।
चैनलरहादोपिस (सीआरआर) हल्के गठित आयन चैनल होते हैं जो मोटीइल हरे शैवाल की आंखों में आते हैं, और फोटॉटैक्सिस और फ़ोबिक प्रतिक्रियाओं के लिए प्राथमिक फोटोसर्स के रूप में काम करते हैं I 2002 2 में अपने पहले विवरण के बाद से, ChRs ने ऑप्टोजेनेटिक्स के उभरते क्षेत्र के लिए मार्ग प्रशस्त किया है और विभिन्न प्रकार के उत्तेजनात्मक कोशिकाओं में लागू किया जा सकता है जैसे कंकाल की मांसपेशियों, हृदय या मस्तिष्क 3 , 4 , 5 । लक्ष्य कोशिकाओं में ChRs का अभिव्यक्ति संबंधित सेल के प्रकाश-नियंत्रणीय आयन पारगम्यता में परिणाम करता है। एक न्यूरॉन संबंधी संदर्भ में, यह क्रियान्वयन 6 , 7 , 8 या अवरोध 9 , एक्शन क्षमता (एपी) फायरिंग के 10 – आयन पर निर्भर करता है – स्थानिक और लौकिक के साथ अनुमति देता हैप्रकाश की सटीकता यह बताती है कि चआर वैरिएशन का आयन चयनात्मकता अपने ऑप्टोजेनेटिक अनुप्रयोग को निर्धारित करता है।
क्लैमाडोमोनस रेनहार्तिय और वोल्वोक्स कार्टरि की पहली खोज की गई चीआर प्रोटॉन के लिए प्रचलित हैं, लेकिन यह भी कैल्शियम और मैग्नीशियम 11 , 12 , 13 जैसे द्विपक्षीय अंशों जैसे सोडियम, पोटेशियम और मोटे तौर पर मोनोएटलेंट कॉमेंट्स के लिए है। आज, 70 से अधिक प्राकृतिक ऋषि-संचालन चैनलरहादोपिस (सीसीआर) 14 , 15 , 16 , 17 और कई इंजीनियर संस्करण 18 , 1 9 , 20 विभिन्न गुणों के साथ जैसे Photocurrent आकार, वर्णक्रमीय संवेदनशीलता, कैनेटीक्स, और cation चयनात्मकता उपलब्ध हैं। जबकि तंत्रिका विज्ञान में, सीसीआर एकफिर कोशिकाओं को सक्रिय करने और एपी को ट्रिगर करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है, प्रकाश-संचालित माइक्रोबियल पंप वर्षों तक न्यूरॉन्स को मुंह बंद करने के लिए केवल उपलब्ध विरोधी थे। 2014 में, दो समूहों ने एक साथ दिखाया कि सीसीआर को एनायन-संचालन चैनलरहादोपिस (एसीआर) में परिवर्तित किया जा सकता है, जो पोटिविटी आयन के साथ आणविक इंजीनियरिंग 9 , 21 के माध्यम से छिद्र को नियंत्रित करते हैं। इसके बाद, प्राकृतिक एसीआर की पहचान कई क्रिप्टोफाइट अल्गा 22 , 23 , 24 में हुई थी । सबसे महत्वपूर्ण बात, एसीआर के प्रकाश सक्रियण वयस्क न्यूरॉन्स में क्लोराइड धाराओं की मध्यस्थता करता है, जो न्यूरोनल गतिविधि के निषेचन की अनुमति देता है, जो माइक्रोइबियल पंपों की तुलना में बहुत कम प्रकाश तीव्रता पर होता है, जो केवल प्रति आरोपित फोटान के लिए एकल शुल्क परिवहन करते हैं।
सीएचआर गतिविधि को सीधे HEK293 कोशिकाओं में प्रकाश-प्रेरित धाराओं के इलेक्ट्रोफिजिकल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग द्वारा संबोधित किया जा सकता है। पैच-दबानातकनीक मूल रूप से 1 9 70 के दशक के अंत में विकसित हुई थी और आगे हामिल एट अल , उच्च मौजूदा संकल्प और झिल्ली वोल्टेज 26 के प्रत्यक्ष नियंत्रण के साथ एक छोटे से सेल (पूरे सेल मोड) से धाराओं की इकाई की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है। सेल संस्कृति में लागू, यह तकनीक ईओणिक के साथ-साथ विद्युत रिकॉर्डिंग स्थितियों के सटीक नियंत्रण प्रदान करती है, और आयनों के सापेक्ष योगदान के साथ कुल वर्तमान के साथ आयन चयनात्मकता का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है। यहाँ हम उच्च क्लोराइड प्रवाहकत्त्व को साबित करने के लिए विभिन्न कोशिकी क्लोराइड सांद्रता के तहत वर्तमान-वोल्टेज संबंधों की रिकॉर्डिंग के माध्यम से प्रोटोनोमोनस सल्काटा (पीसी एसीआर 1) 22 , 23 के आयनों-संचालन चैनलरहादोपसिन के लिए आयन चयनात्मकता की जांच करते हैं।
परिभाषित आयनिक और विद्युत परिस्थितियों में प्रतिवर्ती क्षमता का निर्धारण, आयन प्रजातियों के बारे में जानकारी प्रदान करता है जो कि ChRs के प्रकाश सक्रियण के बाद ले जाया जाता है। यदि विशेष रूप से एक आयन प्…
The authors have nothing to disclose.
उत्कृष्ट सहयोग के लिए हम मेला रेह, थारसेना थर्मिंगम और विशेष रूप से अल्टीना क्लेन का धन्यवाद करते हैं यह काम जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी) (एसएफबी 1078 बी 2, फॉर 1279 एसपीपी 1665 से पीएच) और उत्प्रेरण एकत्रीकरण अवधारणाओं का क्लस्टर, यूनिटाट, बिग-एनएसई (जेवी) और ई 4 (पीएच) के द्वारा समर्थित था।
HEK293 cells | Sigma Aldrich | 85120602 | Human embryonic kidney cells |
Retinal | Sigma Aldrich | R2500 | all-trans retinal |
FuGENE HD | Promega | E2312 | Transfection reagent |
DMEM | Biochrome | FG 0445 | Dulbecco's Modified Eagle Medium |
Agarose | Roth | 3810 | Agar bridges |
CaCl2 | Roth | 5239 | CaCl2 2H2O |
CsCl | Biomol | 2452 | |
EGTA | Roth | 3054 | |
FBS | Biochrome | S0615 | Cell culture |
Glucose | Roth | HN06 | D(+)-Glucose |
KCl | Roth | 6781 | |
MgCl2 | Roth | 2189 | MgCl2 6H2O |
NaCl | Roth | 3957 | |
NMG | Sigma Aldrich | M2004 | N-Methyl-D-glucamine |
Na-Aspartate | Sigma Aldrich | A6683 | L-Aspartic acid sodium salt monohydrate |
Citric acid | Roth | 6490 | |
AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | Restriction enzyme |
XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | Restriction enzyme |
NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | Restriction enzyme |
XL1Blue E.coli/ | Agilent Technologies | 200249 | Chemocompetent E.coli |
Kanamycin | Roth | T832 | |
Lysogeny broth medium | Roth | X964 | |
Agar-Agar | Roth | 6494 | Agar plates |
Plasmid purification kit | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
Penicilin/Streptomycin | Biochrome | A 2213 | Cell culture |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407-5MG | Cover slip coating |
Microforge | Custom made | Fire polishing | |
Serological pipettes | TPP | Different sizes | |
Clean bench | Kojair | Biowizard SL130 | |
Stirrer | IKA | RCT classic | |
Silver wire | Science Products | AG-T25; AG-T10 | Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode) |
pH-meter | Knick | 765 Calimetric | |
Osmometer | Vogel | OM 815 | |
Microscope | Carl Zeiss | ID03 | Fire polishing |
CO2 incubator | Binder | CB150 | |
Cell culture dishes | TPP | 93040 | 34 mm internal diameter |
Cover slips | Roth | P232 | 15 mm diameter |
Thermometer | Rössel Messtechnik | MTM12 | |
Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 transmission |
Pipette holder | ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
Amplifier | Molecular Devices | AxoPatch200B | |
Digitizer | Molecular Devices | DigiData1400 | Digital analog converter |
Lightsource | TILL Photonics | Polychrome V | Set to 540 nm full intensity |
Microscope | Carl Zeiss | Axiovert 100 | |
Shutter | Vincent Associates | VS25 | |
Shutter driver | Vincent Associates | VCM-D1 | |
Glass capilarries | Warner Instruments | G150F-3 | Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID 0.86 mm |
Micropipette puller | Sutter Instruments | P1000 | |
Bath handler | Lorenz Messgerätebau | MPCU | |
Tripleband filterset | Chroma | 69008 | Fluorescence filter ECFP/EYFP/mCherry |
CCD camera | Watec | Wat-221SCCD | |
Optometer | Gigahertz Optik | P9710 | Measure light intensities |
Objective | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC |
Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | |
Recording chamber | Custom made | ||
Power supply | Manson | HCS-3202 | Avoids electrical noise from microscope built-in power supply |
Vibration isolated table | Newport | M-VW-3636-OPT-01 | |
Faraday cage | Custom made or any commercial matching table | ||
Hoses | Any comercial; e.g. Roth | Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges | |
Linear shaker | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
Liquid junction potential calculator | Molecular Devices or directly from Peter H. Barry | Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from p.barry@unsw.edu.au | |
Data acquisition software | Molecular Devices | Clampex 10.X | |
Data evaluation software | Molecular Devices | Clampfit 10.X | |
PsACR1 | GenBank or Addgene | KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 | Gene encoding for PsACR1 |
Amplifier guide | Molecular Devices | The Axon Guide |