Aqui, o estudo de diferentes abordagens de reconhecimento de lesões de DNA por meio de imagens AFM de molécula única é demonstrado com o sistema de reparo por excisão de nucleotídeos como exemplo. Os procedimentos de preparações de amostras de DNA e proteína e detalhes experimentais, bem como analíticos para os experimentos de AFM são descritos.
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Artigo de método
Microscopia de Força Atômica Investigações do Reconhecimento de Lesão de DNA no Reparo de Excisão de Nucleótidos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A imagem de imagem do AFM é uma técnica poderosa para o estudo de interações do proteína-ADN. Este método de molécula única permite a resolução simultânea de diferentes moléculas e conjuntos moleculares em uma amostra heterogênea. No contexto particular dos sistemas de proteínas que interagem com o DNA, diferentes formas de complexos proteicos e suas posições de ligação correspondentes em locais-alvo contendo fragmentos de DNA podem ser distinguidas. Aqui, é apresentada uma aplicação do AFM ao estudo do reconhecimento de lesões de DNA nos sistemas de reparo de DNA por excisão de nucleotídeos procarióticos e eucarióticos (NER). Os procedimentos de preparação de amostras de DNA e proteínas são descritos e detalhes experimentais e analíticos dos experimentos são fornecidos. Os dados permitem conclusões importantes sobre as estratégias pelas quais a verificação do local-alvo pode ser alcançada pelas proteínas NER. Curiosamente, eles indicam diferentes abordagens de reconhecimento e identificação de lesões para o sistema NER eucariótico, dependendo do tipo de lesão. Além disso, propriedades estruturais distintas das duas diferentes helicases envolvidas no NER procariótico e eucariótico resultam e explicam as diferentes estratégias observadas para esses dois sistemas. É importante ressaltar que essas abordagens experimentais e analíticas podem ser aplicadas não apenas ao estudo do reparo do DNA, mas também de forma muito semelhante a outros sistemas de proteínas que interagem com o DNA, como aqueles envolvidos nos processos de replicação ou transcrição.
Introdução
A microscopia de força atômica (AFM) é uma poderosa técnica para a análise das interações proteína-DNA 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Requer apenas baixas quantidades de material de amostra para visualizar diretamente amostras heterogêneas com uma resolução no nível de molécula única. A heterogeneidade pode resultar de diferentes estados conformacionais ou oligomé....
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Protocolo
1. Preparação da amostra
- Preparação de substratos de ADN 11
- Gerando um gap ssDNA no plasmídeo
- Digerir completamente uma amostra do plasmídeo (aqui: pUC19 modificado, pUC19N) num tubo de reacção com uma nickase apropriada (aqui: Nt.BstNBI) seguida por inactivação por calor enzimático, utilizando condições de acordo com o protocolo do fabricante (ver a Figura 1 para um esquema apresentação). Comece com ~ 50 μL e ~ 500 nM plasmídeo para um rendimento suficiente.
- Verificar plasmídeo entalhamento por electroforese em gel de agarose em amostras diluídas (~ 20 nM) 15 . Us....
- Gerando um gap ssDNA no plasmídeo
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Resultados
Distinguir entre diferentes tipos complexos baseados em volumes complexos de proteínas
A actividade de helicase da NER helicase UvrB procariótica é estimulada pela ligação ao ADN 22 , 23 . UvrB requer uma região não emparelhada no ADN (uma bolha de ADN) de modo a carregar correctamente numa das duas cadeias simples de ADNcs. In vivo , esta estrutura de ADN é prop.......
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Discussão
As análises estatísticas de AFM de posições de ligação de proteínas em fragmentos de ADN longos que contêm locais alvo específicos podem revelar detalhes interessantes sobre as estratégias particulares utilizadas pela proteína para reconhecer estes sítios 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Para interpretar as distribuições de posição resultantes, as posições dos alvos no DN.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
PUC19N, oligonucleótidos contendo CPD e p44 foram gentilmente fornecidos por Samuel Wilson, Korbinian Heil e Thomas Carell, e Gudrun Michels e Caroline Kisker, respectivamente. Este trabalho foi apoiado por doações da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 e TE-671/4 para TI.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sonda de Força Molecular (MFP) | 3D Asylum Research | N/A | microscópio de força atômica (AFM) |
| Precision 390 | DELL | N/A | computador |
| ThermoMixer e bloco de 1,5 mL | Eppendorf | 5382000015 | para preparação de DNA |
| Rotilabo Block-Heater H 250 & blocos para tubos de 0,5 mL | Carl Roth GmbH | Y264.1 & Bloco de calor Y267.1 | para incubações de proteína-DNA |
| Mini-Subcélula GT | Bio-Rad Laboratories GmbH | Câmara de | eletroforese 1704467 com rodízio de gel e fonte de alimentação |
| Power Pac Basic | Bio-Rad Laboratories GmbH | Fonte de | alimentação de eletroforese |
| Centifuge 5415 D com rotor | Eppendorf | 2262120-3 | centrífuga de mesa |
| Ultra-Lum UV eletrônico transilhonador MEB-15 | Ultralum | 900-1322-02 | Mesa de irradiação UV |
| NanoDrop ND-1000 | VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH | N/A | UV espectrofotômetro |
| TKAX-CAD com 0,2 μ m filtro de cápsula | Unity Lab Services | N / A | unidade de deionização e filtro de água |
| Nome< / strong> | Empresa< / strong> | Número de catálogo< / strong> | Comentários< / strong> |
| Software< / strong > | |||
| MFP software em Igor Pro | Asylum Research | N / A | AFM software |
| ImageJ (processamento de imagens Java de código aberto) | NIH Image | N/A | Software de análise de imagem |
| Excel (Microsoft Office) | Microsoft Corporation | N/A | software de análise de dados |
| Origin9 / Origin2016 | OriginLab Corporation | N/A | software de análise de dados estatísticos e gráficos |
| Nome< | strong>Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Material | |||
| OMCL-AC240TS | Olympus | OMCL-AC240TS | AFM cantilevers |
| grau V-5 moscovita | SPI Supplies | 1805 | folhas de mica |
| Amicon Ultra 0,5 mL 50k Ultracell | Millipore Ireland Ltd. | UFC505096 | filtros de centrífuga |
| NucleoSpin Extract II | Macherey-Nagel GmbH | 740 609.250 | Kit de extração de gel de agarose |
| Papel de celulose Rotilabo tipo 111A | Carl Roth GmbH | AP59.1 | Papel mata-borrão de deposição |
| AFM Anatop 25 (0,02 μ m) | Whatman GmbH | 6809-2102 | filtro de seringa |
| SSpI, BspQI | New England Biolabs (NEB) | R0132, R0712 | enzimas de restrição para preparação de substrato de DNA |
| XhoI, BglII | R0146, R0144 | enzimas de restrição para preparação de DNA | |
| controla a enzima de restrição de corte Nt.BstNBI | New England Biolabs (NEB) | R0607 | nickase |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs (NEB) | M0202S | Ligase |
| Tris, HEPES | Carl Roth GmbH | 4855, 9105 | produtos químicos tampão |
| NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate | Carl Roth GmbH | 3957, HN03, HN02, P026 | produtos químicos de sal |
| NaAc | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 32318 | produtos químicos de sal |
| DTT, TCEP, EDTA | 6908, HN95, 8040 | produtos químicos/ reagentes | |
| agarose, ácido acético, HCl | Carl Roth GmbH | 2267, 3738, K025 | reagentes |
| ATP | Carl Roth GmbH | K054 | nucleotídeos |
| oligonucleotídeo #1 na Tabela 1 | Biômeros | oligonucleotídeos de DNA complementares personalizados oligonucleotídeos | |
| #2, #3 e #6 na Tabela 1 | Tecnologias de DNA Integradas (IDT) | fluoresceína personalizada contendo oligonucleotídeos | |
| oligonucleotídeos #4 e #5 na Tabela 1 | privado (disponível em, por exemplo, TriLink ou GlenResearch) | CPD contendo oligonucleotídeos | |
| Tubo de reação SafeSeal 0,5 mL e 1,5 mL | Sarstedt | 72.704 e 72.706 | tubos de incubação |
| GeneRuler 1 kb | Thermo Scientific | SM0311 | DNA ladder |
| 6x concentrado gel carregamento corante roxo | Novo England Biolabs (NEB) | 51406 | Corante de carregamento de DNA |
| Midori Green | Nippon Genetics Europe GmbH | 999MG28055 | Coloração de DNA |
Referências
- Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture. J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).
- Wang, H., et al. DNA bending and unbending by MutS ....
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Reimpressões e permissões
