Method Article

Investigações por microscopia de força atômica para o reconhecimento de lesões de DNA no reparo por excisão de nucleotídeos

DOI:

10.3791/55501

⸱

May 24th, 2017

 ,  , 
1Rudolf Virchow Center for Experimental Biomedicine, University of Würzburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, o estudo de diferentes abordagens de reconhecimento de lesões de DNA por meio de imagens AFM de molécula única é demonstrado com o sistema de reparo por excisão de nucleotídeos como exemplo. Os procedimentos de preparações de amostras de DNA e proteína e detalhes experimentais, bem como analíticos para os experimentos de AFM são descritos.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A imagem de imagem do AFM é uma técnica poderosa para o estudo de interações do proteína-ADN. Este método de molécula única permite a resolução simultânea de diferentes moléculas e conjuntos moleculares em uma amostra heterogênea. No contexto particular dos sistemas de proteínas que interagem com o DNA, diferentes formas de complexos proteicos e suas posições de ligação correspondentes em locais-alvo contendo fragmentos de DNA podem ser distinguidas. Aqui, é apresentada uma aplicação do AFM ao estudo do reconhecimento de lesões de DNA nos sistemas de reparo de DNA por excisão de nucleotídeos procarióticos e eucarióticos (NER). Os procedimentos de preparação de amostras de DNA e proteínas são descritos e detalhes experimentais e analíticos dos experimentos são fornecidos. Os dados permitem conclusões importantes sobre as estratégias pelas quais a verificação do local-alvo pode ser alcançada pelas proteínas NER. Curiosamente, eles indicam diferentes abordagens de reconhecimento e identificação de lesões para o sistema NER eucariótico, dependendo do tipo de lesão. Além disso, propriedades estruturais distintas das duas diferentes helicases envolvidas no NER procariótico e eucariótico resultam e explicam as diferentes estratégias observadas para esses dois sistemas. É importante ressaltar que essas abordagens experimentais e analíticas podem ser aplicadas não apenas ao estudo do reparo do DNA, mas também de forma muito semelhante a outros sistemas de proteínas que interagem com o DNA, como aqueles envolvidos nos processos de replicação ou transcrição.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A microscopia de força atômica (AFM) é uma poderosa técnica para a análise das interações proteína-DNA 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Requer apenas baixas quantidades de material de amostra para visualizar diretamente amostras heterogêneas com uma resolução no nível de molécula única. A heterogeneidade pode resultar de diferentes estados conformacionais ou oligomé....

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Protocol

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1. Preparação da amostra

  1. Preparação de substratos de ADN 11
    1. Gerando um gap ssDNA no plasmídeo
      1. Digerir completamente uma amostra do plasmídeo (aqui: pUC19 modificado, pUC19N) num tubo de reacção com uma nickase apropriada (aqui: Nt.BstNBI) seguida por inactivação por calor enzimático, utilizando condições de acordo com o protocolo do fabricante (ver a Figura 1 para um esquema apresentação). Comece com ~ 50 μL e ~ 500 nM plasmídeo para um rendimento suficiente.
      2. Verificar plasmídeo entalhamento por electroforese em gel de agarose em amostras diluídas (~ 20 nM) 15 . Us....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Distinguir entre diferentes tipos complexos baseados em volumes complexos de proteínas

A actividade de helicase da NER helicase UvrB procariótica é estimulada pela ligação ao ADN 22 , 23 . UvrB requer uma região não emparelhada no ADN (uma bolha de ADN) de modo a carregar correctamente numa das duas cadeias simples de ADNcs. In vivo , esta estrutura de ADN é prop.......

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Discussion

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As análises estatísticas de AFM de posições de ligação de proteínas em fragmentos de ADN longos que contêm locais alvo específicos podem revelar detalhes interessantes sobre as estratégias particulares utilizadas pela proteína para reconhecer estes sítios 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Para interpretar as distribuições de posição resultantes, as posições dos alvos no DN.......

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Disclosures

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Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

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PUC19N, oligonucleótidos contendo CPD e p44 foram gentilmente fornecidos por Samuel Wilson, Korbinian Heil e Thomas Carell, e Gudrun Michels e Caroline Kisker, respectivamente. Este trabalho foi apoiado por doações da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 e TE-671/4 para TI.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sonda de Força Molecular (MFP)3D Asylum ResearchN/Amicroscópio de força atômica (AFM)
Precision 390DELLN/Acomputador
ThermoMixer e bloco de 1,5 mLEppendorf5382000015para preparação de DNA
Rotilabo Block-Heater H 250 & blocos para tubos de 0,5 mLCarl Roth GmbHY264.1 & Bloco de calor Y267.1para incubações de proteína-DNA
Mini-Subcélula GTBio-Rad Laboratories GmbHCâmara deeletroforese 1704467 com rodízio de gel e fonte de alimentação
Power Pac BasicBio-Rad Laboratories GmbHFonte dealimentação de eletroforese
Centifuge 5415 D com rotorEppendorf2262120-3centrífuga de mesa
Ultra-Lum UV eletrônico transilhonador MEB-15Ultralum900-1322-02Mesa de irradiação UV
NanoDrop ND-1000VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbHN/AUV espectrofotômetro
TKAX-CAD com 0,2 μ m filtro de cápsulaUnity Lab ServicesN / Aunidade de deionização e filtro de água
Nome< / strong>Empresa< / strong>Número de catálogo< / strong>Comentários< / strong>
Software< / strong >
MFP software em Igor ProAsylum ResearchN / AAFM software
ImageJ (processamento de imagens Java de código aberto)NIH ImageN/ASoftware de análise de imagem
Excel (Microsoft Office)Microsoft CorporationN/Asoftware de análise de dados
Origin9 / Origin2016OriginLab CorporationN/Asoftware de análise de dados estatísticos e gráficos
Nome<strong>EmpresaNúmero de catálogoComentários
Material
OMCL-AC240TSOlympusOMCL-AC240TSAFM cantilevers
grau V-5 moscovitaSPI Supplies1805folhas de mica
Amicon Ultra 0,5 mL 50k UltracellMillipore Ireland Ltd.UFC505096filtros de centrífuga
NucleoSpin Extract II   Macherey-Nagel GmbH740 609.250Kit de extração de gel de agarose
Papel de celulose Rotilabo tipo 111ACarl Roth GmbHAP59.1Papel mata-borrão de deposição
AFM Anatop 25 (0,02 μ m)Whatman GmbH6809-2102filtro de seringa
SSpI, BspQINew England Biolabs (NEB)R0132, R0712enzimas de restrição para preparação de substrato de DNA
XhoI, BglIIR0146, R0144enzimas de restrição para preparação de DNA
controla a enzima de restrição de corte Nt.BstNBINew England Biolabs (NEB)R0607nickase
T4 DNA ligaseNew England Biolabs (NEB)M0202SLigase
Tris, HEPESCarl Roth GmbH4855, 9105produtos químicos tampão
NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetateCarl Roth GmbH3957, HN03, HN02, P026produtos químicos de sal
NaAcSigma-Aldrich Chemie GmbH32318produtos químicos de sal
DTT, TCEP, EDTA6908, HN95, 8040produtos químicos/ reagentes
agarose, ácido acético, HClCarl Roth GmbH2267, 3738, K025reagentes
ATPCarl Roth GmbHK054nucleotídeos
oligonucleotídeo #1 na Tabela 1Biômerosoligonucleotídeos de DNA complementares personalizados oligonucleotídeos
#2, #3 e #6 na Tabela 1Tecnologias de DNA Integradas (IDT)fluoresceína personalizada contendo oligonucleotídeos
oligonucleotídeos #4  e #5 na Tabela 1privado (disponível em, por exemplo, TriLink ou GlenResearch)CPD contendo oligonucleotídeos
Tubo de reação SafeSeal 0,5 mL e 1,5 mLSarstedt72.704 e 72.706tubos de incubação
GeneRuler 1 kbThermo ScientificSM0311DNA ladder
6x concentrado gel carregamento corante roxoNovo England Biolabs (NEB)51406Corante de carregamento de DNA
Midori Green Nippon Genetics Europe GmbH999MG28055Coloração de DNA
Bloco de calor 1645050

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture. J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).
  2. Wang, H., et al. DNA bending and unbending by MutS ....

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Atomic Force MicroscopyDNA Lesion RecognitionNucleotide Excision RepairProtein DNA InteractionsAFM ImagingDNA Substrate PreparationXPD p44 ComplexHelicase ActivationLesion Binding PositionAFM Data Analysis

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