Atommikroskopie Untersuchungen zur DNA-Läsionserkennung bei der Nucleotide Excision Repair
Summary
Here, the study of different DNA lesion recognition approaches via single molecule AFM imaging is demonstrated with the nucleotide excision repair system as an example. The procedures of DNA and protein sample preparations and experimental as well as analytical details for the AFM experiments are described.
Abstract
AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different molecules and molecular assemblies in a heterogeneous sample. In the particular context of DNA interacting protein systems, different protein complex forms and their corresponding binding positions on target sites containing DNA fragments can thus be distinguished. Here, an application of AFM to the study of DNA lesion recognition in the prokaryotic and eukaryotic nucleotide excision DNA repair (NER) systems is presented. The procedures of DNA and protein sample preparations are described and experimental as well as analytical details of the experiments are provided. The data allow important conclusions on the strategies by which target site verification may be achieved by the NER proteins. Interestingly, they indicate different approaches of lesion recognition and identification for the eukaryotic NER system, depending on the type of lesion. Furthermore, distinct structural properties of the two different helicases involved in prokaryotic and eukaryotic NER result in and explain the different strategies observed for these two systems. Importantly, these experimental and analytical approaches can be applied not only to the study of DNA repair but also very similarly to other DNA interacting protein systems such as those involved in replication or transcription processes.
Introduction
Atomkraftmikroskopie (AFM) ist eine leistungsfähige Technik für die Analyse der Protein-DNA-Wechselwirkungen 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Es erfordert nur geringe Mengen an Probenmaterial, um heterogene Proben direkt mit einer Auflösung auf Einzelmolekülebene zu visualisieren. Heterogenität kann aus verschiedenen konformationellen oder oligomeren Zuständen eines Proteins resultieren. Insbesondere können im Rahmen von Protein-DNA-Proben Proteinkomplexe unterschiedliche Stöchiometrien und / oder Konformationen aufweisen, die durch DNA-Bindung im Allgemeinen induziert werden oder an eine spezifische Zielstelle innerhalb der DNA binden. Heterogene Proben können auch zwei (oder mehrere) verschiedene Arten von Proteinen und verschiedene Proteinkomplexe enthaltenFormen ( zB bestehend aus nur einer Art von Protein gegenüber heteromeren Komplexen) können unterschiedlich mit DNA interagieren. Die hier diskutierten Studien nutzten die AFM-Bildgebung in der Luft auf statischen, getrockneten Proben von DNA-Reparaturproteinen, die an lange (~ 900 Basenpaare, bp) DNA-Fragmente gebunden sind, die eine Läsion enthalten, die ein Ziel dieser Proteine darstellt. Die hohe molekulare Auflösung von AFM ermöglicht die Unterscheidung zwischen verschiedenen Arten von Proteinkomplexen und die Bestimmung der Bindungspositionen der Proteine an den DNA-Fragmenten. Wichtig ist, dass die Läsionen in gut definierten Positionen in die DNA-Substrate eingebracht werden. Da die Position der Läsionsstelle in der DNA bekannt ist, liefern die Verteilungen von Proteinen, die an DNA gebunden sind, einen Einblick in (verschiedene) Läsionserkennungseigenschaften der (verschiedenen) Proteinkomplexe, zB wie gut sie eine bestimmte Art von Läsion erkennen (verglichen Zu nicht beschädigter DNA) 2 , 3 , <supClass = "xref"> 4 , 5 , 6 . Ihre Positionen auf der DNA erlauben auch die Unterscheidung zwischen Proteinkomplexen, die spezifisch an den Läsionen und Komplexen gebunden sind, die unspezifisch anderswo an der DNA gebunden sind. Eine getrennte Charakterisierung dieser verschiedenen komplexen Typen (Komplexe, die spezifisch an der Läsion gegenüber unspezifischen Komplexen gebunden sind) können potentielle Konformationsänderungen in den Komplexen zeigen, die bei der Zielortidentifizierung induziert werden.
Die DNA-Reparaturproteine, die hier konzentriert sind, sind Helicasen, die für die Läsionserkennung in der Nucleotide Exzision Reparatur (NER) Weg verantwortlich sind. In Bakterien wird NER durch die Proteine UvrA, UvrB und UvrC erreicht. UvrA ist verantwortlich für die initiale Läsionserfassung in einem UvaA 2 / UvrB 2 DNA-Scan-Komplex. Nach der Läsionsüberprüfung durch UvrB wandelt sich dieser Komplex in monomeres UvrB um, das an der Läsionsstelle gebunden ist, und dieser spezifische Komplex kann dann das p rekrutierenRokaryotische NER Endonuklease UvrC. UvrC verbreitet eine kurze (12-13 nt) Strecke einzelsträngiger DNA (ssDNA), die die Läsion enthält. Die fehlende Dehnung wird dann durch DNA-Polymerase nachgefüllt. Schließlich versiegelt die DNA-Ligase die neu synthetisierte Dehnung mit der ursprünglichen DNA 9 , 10 . Bei Eukaryonten sind die meisten Proteine der NER-Kaskade Teil des großen, multimeren Transkriptionsfaktors II H (TFIIH) -Komplexes. Nach der ersten Läsionserfassung über den trimeren CEN2-XPC-HR23B-Komplex wird TFIIH an die DNA-Zielstelle rekrutiert. Wenn XPD innerhalb des Komplexes die Anwesenheit einer NER-Zielläsion verifiziert, werden die eukaryotischen NER-Endonukleasen XPG und XPF rekrutiert, um eine kurze (24-32 nt) Strecke von ssDNA, die die Läsion 9 , 10 enthält , zu exzimieren. Hier wurden insbesondere die Helicasen UvrB und XPD aus prokaryotischem und eukaryotischem NER untersucht. Diese Helicases erfordern eine ungepaarte Region in derDNA (eine DNA-Blase), um auf einen der beiden DNA-Einzelstränge zu fädeln und anschließend entlang diesem durch ATP-Hydrolyse angefeuerten Strang zu translozieren. Zusätzlich zu den DNA-Läsionen wurde daher eine DNA-Blase in die Substrate eingeführt, die als Ladestelle für die Proteine fungieren.
Das Verfahren zur Herstellung von spezifischen Läsions-DNA-Substraten wurde zuvor beschrieben 11 . Es erfordert ein kreisförmiges DNA-Konstrukt (Plasmid) mit zwei eng beabstandeten Restriktionsstellen für eine Nickase. Im Rahmen dieser Studie wurde das Plasmid pUC19N (2729 bp) verwendet (erstellt von S. Wilsons Laboratorium, NIEHS). Dieses Plasmid enthält drei eng beabstandete Restriktionsstellen für die Nickel Nt.BstNBI, die eine 48 Nukleotid (nt) Streckung bilden. Nach der Inkubation mit der Nickel kann die Strecke der ssDNA zwischen diesen Stellen entfernt und durch ein Oligonukleotid ersetzt werden, das ein beliebiges Zielmerkmal enthält. Nach jedem Schritt wird die vollständige enzymatische Verdauung über Agarosegel getestetElektrophorese Die vernetzte zirkuläre DNA kann aufgrund ihrer geringeren elektrophoretischen Beweglichkeit gegenüber dem ursprünglichen supercoiled Plasmid unterschieden werden. Das Anhängen der DNA und das Ersetzen der entfernten Dehnung durch das spezifische Substrat-Oligonukleotid können durch Verdauung mit einem Restriktionsenzym ausgewertet werden, das das Substrat ausschließlich innerhalb des Bereichs zwischen den Nicks aufnimmt. Die Linearisierung des zirkulären Plasmids durch das Enzym wird daher für die gapped DNA unterdrückt und nach der Insertion des spezifischen Oligonukleotids wiederhergestellt. Schließlich erlauben zwei Endonuklease-Restriktionsstellen (idealerweise Einzelschneider) die Erzeugung eines linearen DNA-Substrats mit der gewünschten Länge und mit der spezifischen Zielstelle an einer definierten Position sowie einer DNA-Blase in einem Abstand von der Läsion entweder in 5 'Oder 3' Richtung.
Die Erkennung der Läsionen durch die NER-Helicasen kann mittels AFM-Bildgebung untersucht werden . Stabile DNA-Translokation der Helicasen bei tEr Läsionsstelle ist als Peak in der Proteinpositionsverteilung auf der DNA sichtbar und zeigt eine Läsionserkennung an. Da die DNA-Translokation dieser Helicinen weiterhin mit einer 5'-bis-3'-Polarität gerichtet ist, zeigt die Abhängigkeit der Läsionserkennung an der Position der Ladestelle (DNA-Blase stromaufwärts oder stromabwärts der Läsion) auch an, ob die Läsion bevorzugt erkannt wird Auf dem translozierten oder auf dem entgegengesetzten, nicht translozierten ssDNA-Strang 5 , 9 . In den folgenden Abschnitten werden die angewandten Methoden eingeführt und wichtige Erkenntnisse aus diesen Experimenten werden kurz diskutiert. Wichtig ist, dass analog zur beispielhaften Arbeit zur hier beschriebenen DNA-Reparatur die AFM-Bildgebung auf die Untersuchung verschiedener DNA-interagierender Systeme wie der DNA-Replikation oder der Transkription 8 , 12 , 13 , 14 angewendet werden kann </Sup>.
Protocol
Representative Results
Discussion
AFM statistische Analysen von Bindungspositionen von Proteinen auf langen DNA-Fragmenten, die spezifische Zielstellen enthalten, können interessante Details über die speziellen Strategien des Proteins zeigen, um diese Stellen 2 , 3 , 4 , 5 , 6 zu erkennen. Um die daraus resultierenden Positionsverteilungen zu interpretieren, müssen die Positionen der Targe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PUC19N, CPD-haltige Oligonukleotide und p44 wurden freundlicherweise von Samuel Wilson, Korbinian Heil und Thomas Carell und Gudrun Michels bzw. Caroline Kisker bereitgestellt. Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 und TE-671/4 an IT unterstützt.
Materials
| Molecular Force Probe (MFP) 3D | Asylum Research | N/A | atomic force microscope (AFM) |
| Precision 390 | DELL | N/A | computer |
| ThermoMixer and 1.5 ml block | Eppendorf | 5382000015 | heat block for DNA preparation |
| Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 ml tubes | Carl Roth GmbH | Y264.1 & Y267.1 | heat block for protein-DNA incubations |
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1704467 | electrophoresis chamber with gel caster and power supply |
| Power Pac Basic | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1645050 | electrophoresis power supply |
| Centifuge 5415 D with rotor | Eppendorf | 2262120-3 | table centrifuge |
| Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 | Ultralum | 900-1322-02 | UV irradiation table |
| NanoDrop ND-1000 | VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH | N/A | UV spectrophotometer |
| TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter | Unity Lab Services | N/A | water deionization and filter unit |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Software | |||
| MFP software on Igor Pro | Asylum Research | N/A | AFM software |
| ImageJ (open source Java image processing) | NIH Image | N/A | Image analysis software |
| Excel (Microsoft Office) | Microsoft Corporation | N/A | data analysis software |
| Origin9 / Origin2016 | OriginLab Corporation | N/A | statistical data analysis and graphing software |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Material | |||
| OMCL-AC240TS | Olympus | OMCL-AC240TS | AFM cantilevers |
| grade V-5 muscovite | SPI Supplies | 1805 | mica sheets |
| Amicon Ultra 0.5ml 50k Ultracell | Millipore Ireland Ltd. | UFC505096 | centrifuge filters |
| NucleoSpin Extract II | Macherey-Nagel GmbH | 740 609.250 | Agarose gel extraction kit |
| Rotilabo cellulose paper type 111A | Carl Roth GmbH | AP59.1 | AFM deposition blotting paper |
| Anatop 25 (0.02 μm) | Whatman GmbH | 6809-2102 | syringe filter |
| SSpI, BspQI | New England Biolabs (NEB) | R0132, R0712 | restriction enzymes for DNA substrate preparation |
| XhoI, BglII | R0146, R0144 | restriction enzymes for DNA preparation controls | |
| nicking restriction enzyme Nt.BstNBI | New England Biolabs (NEB) | R0607 | nickase |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs (NEB) | M0202S | Ligase |
| Tris, HEPES | Carl Roth GmbH | 4855, 9105 | buffer chemicals |
| NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate | Carl Roth GmbH | 3957, HN03, HN02, P026 | salt chemicals |
| NaAc | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 32318 | salt chemicals |
| DTT, TCEP, EDTA | 6908, HN95, 8040 | chemicals/reagents | |
| agarose, acetic acid, HCl | Carl Roth GmbH | 2267, 3738, K025 | reagents |
| ATPƔS | Jena Bioscience | NU-406 | nucleotides |
| ATP | Carl Roth GmbH | K054 | nucleotides |
| oligonucleotide #1 in Table 1 | Biomers | custom | complementary DNA oligonucleotide |
| oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | custom | fluorescein containing oligonucleotides |
| oligonucleotides #4 and #5 in Table 1 | private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) | CPD containing oligonucleotides | |
| SafeSeal reaction tube 0.5 ml and 1.5 ml | Sarstedt | 72.704 and 72.706 | incubation tubes |
| GeneRuler 1 kb | Thermo Scientific | SM0311 | DNA ladder |
| 6x concentrate gel loading dye purple | New England Biolabs (NEB) | 51406 | DNA loading dye |
| Midori Green | Nippon Genetics Europe GmbH | 999MG28055 | DNA stain |
Referências
- Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture. J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).
- Wang, H., et al. DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).
- Tessmer, I., et al. Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair. J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).
- Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer. Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).
- Buechner, C. N., et al. Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility. J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).
- Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering. Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).
- Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids. Methods. 60, 113-121 (2013).
- Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Bioquímica. 51, 1500-1509 (2012).
- Wirth, N., et al. Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition. J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).
- Kuper, J., Kisker, C. Damage recognition in nucleotide excision DNA repair. Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).
- Buechner, C. N., Tessmer, I. DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions. J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).
- Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Sci. Rep. 5, 9625 (2015).
- Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy. Phys. Biol. 9 (2), 021001 (2012).
- Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex. EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).
- Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, (2012).
- Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair. EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).
- Kuper, J., et al. In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair. PLoS Biol. 12 (9), e1001954 (2014).
- Shlyakhtenko, L. S., et al. Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials. Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).
- Roth, H. M., et al. XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1. DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).
- Ratcliff, G. C., Erie, D. A. A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants. J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).
- Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions. Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).
- Caron, P. R., Grossman, L. Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair. Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).
- Wang, H., et al. UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity. J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).
- Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging. Methods. 60 (2), 122-130 (2013).
- Truglio, J. J., et al. Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB. Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).
- Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation. EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).
- Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands. EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).
- Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition. EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).
- Moolenaar, G. F., et al. The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair. J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).
