Investigações por microscopia de força atômica para o reconhecimento de lesões de DNA no reparo por excisão de nucleotídeos
Summary
Here, the study of different DNA lesion recognition approaches via single molecule AFM imaging is demonstrated with the nucleotide excision repair system as an example. The procedures of DNA and protein sample preparations and experimental as well as analytical details for the AFM experiments are described.
Abstract
AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different molecules and molecular assemblies in a heterogeneous sample. In the particular context of DNA interacting protein systems, different protein complex forms and their corresponding binding positions on target sites containing DNA fragments can thus be distinguished. Here, an application of AFM to the study of DNA lesion recognition in the prokaryotic and eukaryotic nucleotide excision DNA repair (NER) systems is presented. The procedures of DNA and protein sample preparations are described and experimental as well as analytical details of the experiments are provided. The data allow important conclusions on the strategies by which target site verification may be achieved by the NER proteins. Interestingly, they indicate different approaches of lesion recognition and identification for the eukaryotic NER system, depending on the type of lesion. Furthermore, distinct structural properties of the two different helicases involved in prokaryotic and eukaryotic NER result in and explain the different strategies observed for these two systems. Importantly, these experimental and analytical approaches can be applied not only to the study of DNA repair but also very similarly to other DNA interacting protein systems such as those involved in replication or transcription processes.
Introduction
A microscopia de força atômica (AFM) é uma poderosa técnica para a análise das interações proteína-DNA 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Requer apenas baixas quantidades de material de amostra para visualizar diretamente amostras heterogêneas com uma resolução no nível de molécula única. A heterogeneidade pode resultar de diferentes estados conformacionais ou oligoméricos de uma proteína. Em particular, no contexto de amostras de proteína-ADN, os complexos de proteínas podem exibir estequiometrias e / ou conformações diferentes induzidas por ligação ao ADN em geral ou ligação a um local alvo específico dentro do ADN. As amostras heterogéneas também podem conter dois (ou mais) tipos diferentes de proteínas e diferentes complexos de proteínas( Por exemplo , consistindo de apenas um tipo de proteína versus complexos heteroméricos) podem interagir de forma diferente com o DNA. Os estudos aqui discutidos exploram imagens AFM no ar em amostras estáticas e secas de proteínas de reparo de DNA ligadas a fragmentos de DNA longos (~ 900 pares de bases, bp) que contêm uma lesão, o que representa um alvo dessas proteínas. A alta resolução molecular do AFM permite a distinção entre diferentes tipos de complexos protéicos e determinar as posições de ligação das proteínas nos fragmentos de DNA. É importante notar que as lesões são introduzidas nos substratos de ADN em posições bem definidas. Uma vez que a posição do local da lesão no DNA é conhecida, as distribuições de proteínas ligadas ao DNA proporcionam uma visão das propriedades (diferentes) de reconhecimento de lesões dos complexos de proteínas (diferentes), por exemplo , como reconhecem um tipo particular de lesão A ADN não danificado) 2 , 3 , <supClass = "xref"> 4 , 5 , 6 . Suas posições no DNA também permitem a distinção entre complexos de proteínas ligados especificamente às lesões e complexos ligados inespecificamente em qualquer outra parte do DNA. A caracterização separada destes diferentes tipos complexos (complexos ligados especificamente à lesão versus complexos não específicos) pode revelar alterações conformacionais potenciais nos complexos induzidas na identificação do local alvo.
As proteínas de reparo do DNA focadas aqui são helicases que são responsáveis pelo reconhecimento de lesão na via de reparo de excisão de nucleotídeos (NER). Em bactérias, o NER é conseguido pelas proteínas UvrA, UvrB e UvrC. UvrA é responsável pela detecção inicial de lesões num complexo de varrimento de ADN UvaA 2 / UvrB 2 . Após a verificação da lesão por UvrB, este complexo converte-se em UvrB monomérico ligado no local da lesão e este complexo específico pode então recrutar o pEndonuclease NER de rokaryotic UvrC. A UvrC excisa um segmento curto (12-13 nt) de ADN de cadeia simples (ssDNA) contendo a lesão. O estiramento em falta é então reenchido pela ADN polimerase. Finalmente, a ADN ligase sela o estiramento recentemente sintetizado com o DNA original 9 , 10 . Em eucariotas, a maioria das proteínas da cascata NER são parte do grande complexo de transcrição do complexo II H (TFIIH). Após detecção de lesão inicial através do complexo trimérico CEN2-XPC-HR23B, TFIIH é recrutado para o local alvo de ADN. Quando XPD dentro do complexo verifica a presença de uma lesão alvo NER, as endonucleases EER eucarióticas XPG e XPF são recrutadas para excisar um trecho curto (24-32 nt) de ssDNA contendo a lesão 9,10 . Aqui, especificamente, foram estudadas as helicases UvrB e XPD de NER procariótico e eucariótico, respectivamente. Estas helicases requerem uma região nãoDNA (uma bolha de ADN) para enfiar numa das duas cadeias simples de ADN e subsequentemente translocar ao longo desta cadeia alimentada por hidrólise de ATP. Além das lesões de DNA, foi introduzida uma bolha de ADN nos substratos que funciona como local de carga para as proteínas.
O procedimento para a preparação de substratos específicos de DNA de lesão já foi descrito anteriormente 11 . Requer uma construção de ADN circular (plasmídeo) com dois locais de restrição estreitamente espaçados para uma nickase. No contexto deste estudo, utilizou-se o plasmídeo pUC19N (2729 pb) (criado pelo laboratório de S. Wilson, NIEHS). Este plasm�eo cont� tr� locais de restri�o espa�dos para a nickase Nt.BstNBI que enquadram um alongamento de 48 nucle�idos (nt). Após incubação com a nquase, o trecho de ssDNA entre estes locais pode ser removido e substituído por um oligonucleótido contendo qualquer característica alvo. Após cada passo, a digestão enzimática completa é testada através de gel de agaroseEletroforese. O ADN circundado circular pode ser distinguido devido à sua mobilidade electroforética inferior em comparação com o plasmídeo super-enrolado original. A separação do ADN e a substituição do estiramento removido pelo oligonucleótido de substrato específico podem ser avaliadas através de digestão com uma enzima de restrição que incisa o substrato exclusivamente dentro da região entre os entalhes. A linearização do plasmídeo circular pela enzima será assim suprimida para o ADN gapped e restaurada após a inserção do oligonucleótido específico. Finalmente, dois locais de restrição de endonuclease (idealmente cortadores únicos) permitem a geração de um substrato de ADN linear, com o comprimento desejado e com o local alvo específico numa posição definida assim como uma bolha de ADN a uma distância da lesão, quer em 5 'Ou 3'.
O reconhecimento das lesões pelas helicases NER pode ser investigado através de imagens AFM. A translocação de ADN bloqueado das helicases em tO local da lesão é visível como um pico na distribuição da posição da proteína no DNA e indica o reconhecimento da lesão. Uma vez que a translocação do ADN destas helicases é ainda direccional, com uma polaridade de 5 'a 3', a dependência do reconhecimento da lesão na posição do local de carga (bolha de ADN a montante ou a jusante da lesão) também indica se a lesão é preferencialmente reconhecida Na cadeia de ssDNA não translocada ou no lado oposto, não translocada 5 , 9 . Nas seções a seguir, os métodos utilizados serão introduzidos e os principais achados dessas experiências serão brevemente discutidos. Importante, analogamente ao trabalho exemplar sobre o reparo de DNA mostrado aqui, a imagiologia AFM pode ser aplicada ao estudo de diferentes sistemas de interação de DNA, tais como replicação ou transcrição de DNA 8 , 12 , 13 , 14 </Sup>.
Protocol
Representative Results
Discussion
As análises estatísticas de AFM de posições de ligação de proteínas em fragmentos de ADN longos que contêm locais alvo específicos podem revelar detalhes interessantes sobre as estratégias particulares utilizadas pela proteína para reconhecer estes sítios 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Para interpretar as distribuições de posição resultantes, as posiçõ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PUC19N, oligonucleótidos contendo CPD e p44 foram gentilmente fornecidos por Samuel Wilson, Korbinian Heil e Thomas Carell, e Gudrun Michels e Caroline Kisker, respectivamente. Este trabalho foi apoiado por doações da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 e TE-671/4 para TI.
Materials
| Molecular Force Probe (MFP) 3D | Asylum Research | N/A | atomic force microscope (AFM) |
| Precision 390 | DELL | N/A | computer |
| ThermoMixer and 1.5 ml block | Eppendorf | 5382000015 | heat block for DNA preparation |
| Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 ml tubes | Carl Roth GmbH | Y264.1 & Y267.1 | heat block for protein-DNA incubations |
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1704467 | electrophoresis chamber with gel caster and power supply |
| Power Pac Basic | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1645050 | electrophoresis power supply |
| Centifuge 5415 D with rotor | Eppendorf | 2262120-3 | table centrifuge |
| Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 | Ultralum | 900-1322-02 | UV irradiation table |
| NanoDrop ND-1000 | VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH | N/A | UV spectrophotometer |
| TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter | Unity Lab Services | N/A | water deionization and filter unit |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Software | |||
| MFP software on Igor Pro | Asylum Research | N/A | AFM software |
| ImageJ (open source Java image processing) | NIH Image | N/A | Image analysis software |
| Excel (Microsoft Office) | Microsoft Corporation | N/A | data analysis software |
| Origin9 / Origin2016 | OriginLab Corporation | N/A | statistical data analysis and graphing software |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Material | |||
| OMCL-AC240TS | Olympus | OMCL-AC240TS | AFM cantilevers |
| grade V-5 muscovite | SPI Supplies | 1805 | mica sheets |
| Amicon Ultra 0.5ml 50k Ultracell | Millipore Ireland Ltd. | UFC505096 | centrifuge filters |
| NucleoSpin Extract II | Macherey-Nagel GmbH | 740 609.250 | Agarose gel extraction kit |
| Rotilabo cellulose paper type 111A | Carl Roth GmbH | AP59.1 | AFM deposition blotting paper |
| Anatop 25 (0.02 μm) | Whatman GmbH | 6809-2102 | syringe filter |
| SSpI, BspQI | New England Biolabs (NEB) | R0132, R0712 | restriction enzymes for DNA substrate preparation |
| XhoI, BglII | R0146, R0144 | restriction enzymes for DNA preparation controls | |
| nicking restriction enzyme Nt.BstNBI | New England Biolabs (NEB) | R0607 | nickase |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs (NEB) | M0202S | Ligase |
| Tris, HEPES | Carl Roth GmbH | 4855, 9105 | buffer chemicals |
| NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate | Carl Roth GmbH | 3957, HN03, HN02, P026 | salt chemicals |
| NaAc | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 32318 | salt chemicals |
| DTT, TCEP, EDTA | 6908, HN95, 8040 | chemicals/reagents | |
| agarose, acetic acid, HCl | Carl Roth GmbH | 2267, 3738, K025 | reagents |
| ATPƔS | Jena Bioscience | NU-406 | nucleotides |
| ATP | Carl Roth GmbH | K054 | nucleotides |
| oligonucleotide #1 in Table 1 | Biomers | custom | complementary DNA oligonucleotide |
| oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | custom | fluorescein containing oligonucleotides |
| oligonucleotides #4 and #5 in Table 1 | private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) | CPD containing oligonucleotides | |
| SafeSeal reaction tube 0.5 ml and 1.5 ml | Sarstedt | 72.704 and 72.706 | incubation tubes |
| GeneRuler 1 kb | Thermo Scientific | SM0311 | DNA ladder |
| 6x concentrate gel loading dye purple | New England Biolabs (NEB) | 51406 | DNA loading dye |
| Midori Green | Nippon Genetics Europe GmbH | 999MG28055 | DNA stain |
Referências
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