Investigaciones de Microscopía de Fuerza Atómica de Reconocimiento de Lesión de ADN en Reparación de Excisión de Nucleótidos
Summary
Here, the study of different DNA lesion recognition approaches via single molecule AFM imaging is demonstrated with the nucleotide excision repair system as an example. The procedures of DNA and protein sample preparations and experimental as well as analytical details for the AFM experiments are described.
Abstract
AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different molecules and molecular assemblies in a heterogeneous sample. In the particular context of DNA interacting protein systems, different protein complex forms and their corresponding binding positions on target sites containing DNA fragments can thus be distinguished. Here, an application of AFM to the study of DNA lesion recognition in the prokaryotic and eukaryotic nucleotide excision DNA repair (NER) systems is presented. The procedures of DNA and protein sample preparations are described and experimental as well as analytical details of the experiments are provided. The data allow important conclusions on the strategies by which target site verification may be achieved by the NER proteins. Interestingly, they indicate different approaches of lesion recognition and identification for the eukaryotic NER system, depending on the type of lesion. Furthermore, distinct structural properties of the two different helicases involved in prokaryotic and eukaryotic NER result in and explain the different strategies observed for these two systems. Importantly, these experimental and analytical approaches can be applied not only to the study of DNA repair but also very similarly to other DNA interacting protein systems such as those involved in replication or transcription processes.
Introduction
La microscopía de fuerza atómica (AFM) es una poderosa técnica para el análisis de las interacciones proteína-ADN 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Requiere sólo cantidades bajas de material de muestra para visualizar directamente muestras heterogéneas con una resolución a nivel de molécula única. La heterogeneidad puede resultar de diferentes estados conformacionales u oligoméricos de una proteína. En particular, en el contexto de muestras de proteína-ADN, los complejos de proteínas pueden mostrar diferentes estequiometrías y / o conformaciones inducidas por unión al ADN en general o unión a un sitio diana específico dentro del ADN. Las muestras heterogéneas también pueden contener dos (o más) tipos diferentes de proteínas, y diferentes complejos de proteínas( Por ejemplo , que consisten en un solo tipo de proteína frente a complejos heteroméricos) pueden interactuar de manera diferente con el ADN. Los estudios analizados aquí explotan imágenes AFM en aire en muestras estáticas y secas de proteínas de reparación de ADN unidas a fragmentos de ADN largos (~ 900 pares de bases, bp) que contienen una lesión, lo que representa un objetivo de estas proteínas. La alta resolución molecular del AFM permite distinguir entre diferentes tipos de complejos de proteínas y determinar las posiciones de unión de las proteínas en los fragmentos de ADN. Es importante destacar que las lesiones se introducen en los sustratos de ADN en posiciones bien definidas. Debido a que la posición del sitio de la lesión en el ADN es conocida, las distribuciones de proteínas unidas al ADN proporcionan una visión de las diferentes propiedades de reconocimiento de lesiones de los diferentes complejos de proteínas, por ejemplo , cuán bien reconocen un tipo particular de lesión A ADN no dañado) 2 , 3 , <supClass = "xref"> 4 , 5 , 6 . Sus posiciones sobre el ADN también permiten la distinción entre los complejos de proteínas unidos específicamente a las lesiones y los complejos unidos no específicamente en otras partes del ADN. La caracterización separada de estos diferentes tipos complejos (complejos unidos específicamente a la lesión frente a complejos no específicos) puede revelar cambios conformacionales potenciales en los complejos inducidos en la identificación del sitio de destino.
Las proteínas de reparación del ADN que se enfocan aquí son helicases que son responsables del reconocimiento de la lesión en la ruta de reparación de escisión de nucleótidos (NER). En las bacterias, NER se logra por las proteínas UvrA, UvrB y UvrC. UvrA es responsable de la detección inicial de lesiones en un complejo de exploración de ADN UvaA 2 / UvrB 2 . Tras la verificación de la lesión por UvrB, este complejo se convierte en UvrB monomérico unido en el sitio de la lesión y este complejo específico puede entonces reclutar el pEndonucleasa NER de rokaryotic UvrC. UvrC excisa un tramo corto (12-13 nt) de ADN monocatenario (ssDNA) que contiene la lesión. El estiramiento que falta es entonces rellenado por ADN polimerasa. Finalmente, la ADN ligasa sella el estiramiento recién sintetizado con el ADN original 9 , 10 . En los eucariotas, la mayoría de las proteínas de la cascada de NER son parte del complejo de factor de transcripción II H (TFIIH) grande y multimérico. Después de la detección de la lesión inicial a través del complejo trimérico CEN2-XPC-HR23B, TFIIH se recluta al sitio diana de ADN. Cuando XPD dentro del complejo verifica la presencia de una lesión NER objetivo, el eucariota NER endonucleasas XPG y XPF son contratados para excise un corto (24-32 nt) tramo de ssDNA que contiene la lesión [ 9 , 10] . Aquí, específicamente, las helicases UvrB y XPD procedentes de NER procariótico y eucariótico, respectivamente, se estudiaron. Estas helicases requieren una región noADN (una burbuja de ADN) para roscar sobre una de las dos cadenas simples de ADN y posteriormente trasladarse a lo largo de esta cadena alimentada por hidrólisis de ATP. Además de las lesiones de ADN, se introdujo una burbuja de ADN en los sustratos que funciona como sitio de carga para las proteínas.
El procedimiento para la preparación de sustratos específicos de ADN de lesión ha sido descrito previamente 11 . Requiere una construcción de ADN circular (plásmido) con dos sitios de restricción estrechamente espaciados para una nickasa. En el contexto de este estudio, se usó el plásmido pUC19N (2729 pb) (creado por el laboratorio de S. Wilson, NIEHS). Este plásmido contiene tres sitios de restricción estrechamente espaciados para la nickasa Nt.BstNBI que enmarcan un estiramiento de 48 nucleótidos (nt). Después de la incubación con la nickasa, el tramo de ssDNA entre estos sitios puede ser eliminado y reemplazado por un oligonucleótido que contiene cualquier característica diana. Después de cada paso, se somete a ensayo la digestión enzimática completa mediante gel de agarosaElectroforesis. Se puede distinguir el ADN circundante circular debido a su menor movilidad electroforética en comparación con el plásmido superenrollado original. La separación del ADN y la sustitución del estiramiento eliminado por el oligonucleótido de sustrato específico se pueden evaluar mediante digestión con una enzima de restricción que incisa el sustrato exclusivamente dentro de la región entre los cortes. La alineación del plásmido circular por la enzima se suprimirá por lo tanto para el ADN gapped y se restaurará después de la inserción del oligonucleótido específico. Por último, dos sitios de restricción de endonucleasa (idealmente cortadores únicos) permiten la generación de un sustrato de ADN lineal, con longitud como se desee y con el sitio diana específico en una posición definida así como una burbuja de ADN a una distancia de la lesión en 5 'O 3'.
El reconocimiento de las lesiones por las helicasas NER puede ser investigado a través de imágenes AFM. La translocación del ADN bloqueado de las helicasas en tEl sitio de la lesión es visible como un pico en la distribución de la posición de la proteína en el ADN e indica el reconocimiento de la lesión. Debido a que la translocación del ADN de estas helicasas es además direccional, con una polaridad de 5 'a 3', la dependencia del reconocimiento de la lesión en la posición del sitio de carga (burbuja de ADN aguas arriba o aguas abajo de la lesión) también indica si la lesión es preferentemente reconocida En el filamento de ssDNA no translocado o en el lado opuesto, 5 , 9 . En las siguientes secciones, se introducirán los métodos utilizados y se discutirán brevemente los hallazgos principales de estos experimentos. Es importante destacar que, análogamente al trabajo ejemplar sobre reparación de ADN mostrado aquí, la formación de imágenes AFM puede aplicarse al estudio de diferentes sistemas de interacción de ADN, tales como la replicación o transcripción de ADN 8 , 12 , 13 , 14 </Sup
Protocol
Representative Results
Discussion
Los análisis estadísticos AFM de posiciones de unión de proteínas en fragmentos de ADN largos que contienen sitios diana específicos pueden revelar detalles interesantes sobre las estrategias particulares empleadas por la proteína para reconocer estos sitios 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Para interpretar las distribuciones de posición resultantes, es necesario c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PUC19N, oligonucleótidos que contienen CPD y p44 fueron amablemente proporcionados por Samuel Wilson, Korbinian Heil y Thomas Carell, y Gudrun Michels y Caroline Kisker, respectivamente. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 y TE-671/4 a IT.
Materials
| Molecular Force Probe (MFP) 3D | Asylum Research | N/A | atomic force microscope (AFM) |
| Precision 390 | DELL | N/A | computer |
| ThermoMixer and 1.5 ml block | Eppendorf | 5382000015 | heat block for DNA preparation |
| Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 ml tubes | Carl Roth GmbH | Y264.1 & Y267.1 | heat block for protein-DNA incubations |
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1704467 | electrophoresis chamber with gel caster and power supply |
| Power Pac Basic | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1645050 | electrophoresis power supply |
| Centifuge 5415 D with rotor | Eppendorf | 2262120-3 | table centrifuge |
| Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 | Ultralum | 900-1322-02 | UV irradiation table |
| NanoDrop ND-1000 | VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH | N/A | UV spectrophotometer |
| TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter | Unity Lab Services | N/A | water deionization and filter unit |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Software | |||
| MFP software on Igor Pro | Asylum Research | N/A | AFM software |
| ImageJ (open source Java image processing) | NIH Image | N/A | Image analysis software |
| Excel (Microsoft Office) | Microsoft Corporation | N/A | data analysis software |
| Origin9 / Origin2016 | OriginLab Corporation | N/A | statistical data analysis and graphing software |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Material | |||
| OMCL-AC240TS | Olympus | OMCL-AC240TS | AFM cantilevers |
| grade V-5 muscovite | SPI Supplies | 1805 | mica sheets |
| Amicon Ultra 0.5ml 50k Ultracell | Millipore Ireland Ltd. | UFC505096 | centrifuge filters |
| NucleoSpin Extract II | Macherey-Nagel GmbH | 740 609.250 | Agarose gel extraction kit |
| Rotilabo cellulose paper type 111A | Carl Roth GmbH | AP59.1 | AFM deposition blotting paper |
| Anatop 25 (0.02 μm) | Whatman GmbH | 6809-2102 | syringe filter |
| SSpI, BspQI | New England Biolabs (NEB) | R0132, R0712 | restriction enzymes for DNA substrate preparation |
| XhoI, BglII | R0146, R0144 | restriction enzymes for DNA preparation controls | |
| nicking restriction enzyme Nt.BstNBI | New England Biolabs (NEB) | R0607 | nickase |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs (NEB) | M0202S | Ligase |
| Tris, HEPES | Carl Roth GmbH | 4855, 9105 | buffer chemicals |
| NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate | Carl Roth GmbH | 3957, HN03, HN02, P026 | salt chemicals |
| NaAc | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 32318 | salt chemicals |
| DTT, TCEP, EDTA | 6908, HN95, 8040 | chemicals/reagents | |
| agarose, acetic acid, HCl | Carl Roth GmbH | 2267, 3738, K025 | reagents |
| ATPƔS | Jena Bioscience | NU-406 | nucleotides |
| ATP | Carl Roth GmbH | K054 | nucleotides |
| oligonucleotide #1 in Table 1 | Biomers | custom | complementary DNA oligonucleotide |
| oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | custom | fluorescein containing oligonucleotides |
| oligonucleotides #4 and #5 in Table 1 | private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) | CPD containing oligonucleotides | |
| SafeSeal reaction tube 0.5 ml and 1.5 ml | Sarstedt | 72.704 and 72.706 | incubation tubes |
| GeneRuler 1 kb | Thermo Scientific | SM0311 | DNA ladder |
| 6x concentrate gel loading dye purple | New England Biolabs (NEB) | 51406 | DNA loading dye |
| Midori Green | Nippon Genetics Europe GmbH | 999MG28055 | DNA stain |
Referências
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