Competenza metabolica dei sistemi in vitro è un requisito fondamentale per la biotrasformazione e la disposizione di farmaci e sostanze tossiche. In questo protocollo, si descrive l'applicazione di sonde metabolici riferimento per valutare fase del metabolismo in colture cellulari.
enzimi che metabolizzano xenobiotici svolgono una funzione chiave nella biotrasformazione di farmaci e sostanze tossiche con l'aggiunta di gruppi funzionali che aumentano la solubilità e facilitano l'escrezione. In alcune occasioni quelle modifiche strutturali portano alla formazione di nuovi prodotti tossici. Al fine di ridurre la sperimentazione sugli animali, rischio chimico può essere valutata utilizzando cellule metabolicamente competenti. L'espressione degli enzimi metabolici, tuttavia, non è stabile nel tempo in molti sistemi di coltura primaria in vitro ed è spesso parziale o assente in linee cellulari. Pertanto, lo studio dei farmaci, additivi, e il metabolismo inquinanti ambientali in vitro dovrebbe idealmente essere condotta in sistemi cellulari in cui l'attività metabolica è stata caratterizzata. Spieghiamo qui un approccio per misurare l'attività di una classe di enzimi metabolici (Fase umana I) in linee cellulari 2D e 3D colture primarie utilizzando sonde chimici ed i loro prodotti metabolici quantificabili mediante spettrometria di massa e UPLCluminometria. Il metodo può essere implementato per testare l'attività metabolica in linee cellulari e cellule primarie derivate da una varietà di tessuti.
Metabolismo xenobiotico è il processo attraverso il quale le sostanze chimiche estranee all'organismo vengono modificati mediante l'aggiunta di gruppi idrofili e coniugati per facilitare il loro escrezione 1. Tipicamente il metabolismo di xenobiotici è un processo in due fasi con la fase I che consiste principalmente di un'ossidazione con l'aggiunta di uno o più gruppi idrossilici 1, 2. Nella fase II, i gruppi ossidrilici sono utilizzati come accettori per un coniugato idrofilo come glucuronide o un solfato porzione 1, 2. Se un gruppo accettore è già presente sulle molecole, la fase di coniugazione può accadere indipendentemente metabolismo Fase I. Ogni reazione è eseguita da un gruppo specifico di enzimi, per esempio, CYP (citocromo P450), che catalizzano l'idrossilazione (figura 1) e dealchilazione di substrati chimici 3. Conjugation è catalizzata da sulfotransferasi, UDP-glicuronosiltransferasi (Figura 1), glutatione-S-transferasi e N-acetiltransferasi 4. Ogni tessuto e organo avranno uno specifico profilo di espressione dell'enzima metabolico, con il fegato esprimere più di queste proteine.
Figura 1: Esempio di fase I e II metabolismo fase per cumarina. CYP2A6 / CYP2A13 catalizzare l'7-idrossilazione di cumarina. 7-idrossicumarina è coniugato ad una porzione glucuronide dalla fase II enzimi UGT, con UGT1A6 e UGT1A9 mostra la più alta attività.
Comprensione del metabolismo degli xenobiotici è critico nella valutazione della sicurezza dei farmaci e per la valutazione del rischio chimico per due motivi: la cinetica di reazione determineranno quanto tempo un farmaco o chimiche rimarrà nel corpo in forma attiva o inattiva brima di escrezione; e il composto genitore può essere modificato per una specie più reattivo, instabile e tossico da enzimi metabolici. Tali reazioni note anche come "bioactivation" sono per lo più guidati da fase I CYP enzimi ma anche in occasioni rare per fase II coniugazione 5.
Sulla base di questo, la capacità di un modello in vitro per prevedere con precisione i rischi associati a un farmaco o una sostanza chimica è fortemente dipendente dalla competenza metabolica del sistema di celle. Linee cellulari derivate da tessuti malati o dalla trasformazione di cellule normali spesso perdono parte se non tutto il profilo metabolico enzima rappresentative del loro tessuto di origine 6. Il mantenimento del normale profilo metabolico enzima appare meglio in colture di cellule primarie (almeno nelle culture breve) ed è ulteriormente migliorata se il tessuto viene coltivato in una matrice permettendo così di mantenere la sua struttura 3D 1. Pertanto, il characterization della competenza metabolica di un sistema cellulare in vitro è un passo preliminare importante nel guidare la decisione su quale modello cellulare è opportuno effettuare valutazioni di sicurezza chimici.
In questo articolo presentiamo un protocollo al profilo l'attività e l'espressione degli enzimi CYP Fase I in vitro con esempi della loro applicazione con una linea di cellule epatiche 7 e colture cellulari primarie polmone 3D 8. substrati specifici CYP, loro prodotti metabolici e inibitore controlli sono descritti insieme spectrometry- massa e di quantificazione luminogenic-based. Poiché alcuni CYP sono inducibili e altri sono costitutive, esempi anche essere dati per questi due scenari.
Attualmente, molti sistemi di test tossicologici standardizzati utilizzano batteri ingegneristiche, linee cellulari o cellule embrionali che non sono rappresentativi della normale metabolismo umano 1. Questo può portare a previsioni inesatte del potenziale attività tossica di una sostanza chimica o medicina. Innovativo in vitro, quali colture cellulari 3D e organo su un chip, vengono sviluppati in un tentativo di replicare meglio la morfologia normale attività metabolica dei tessuti umani 21, 22, 23. competenza metabolica è un criterio che può essere utilizzato per decifrare quali modelli sono più adatti per gli studi di valutazione e di biotrasformazione di droga tossicologici.
Il protocollo che abbiamo descritto in questo documento è progettato per misurare l'attività degli enzimi CYP utilizzando cellule vive. È flessibile e può essere utilizzato per diversi sistemi cellulari in 2D o 3D culturES e offre la possibilità di utilizzare un probe- luminogenic o di un approccio basato su spettrometria di massa. Entrambi i metodi sono sufficientemente sensibili per rilevare quantità nanogrammi di materiali e richiedono solo un piccolo numero di cellule cresciute in un formato multipozzetto. Essi possono anche essere applicati a sferoide o cellule coltivate in matrici complesse. La scelta del substrato sonda è ovviamente un elemento critico del protocollo. La specificità del test si basa sulla sonda essere selettivi dell'enzima CYP e un altro strato di affidabilità può essere ottenuta mediante l'impiego di un inibitore selettivo CYP. I substrati e inibitori elencati nel presente documento sono solo alcuni esempi, ma altri possono essere trovati nella letteratura.
È importante considerare diversi tempi di incubazione quando si lavora con un nuovo tipo di cella come CYP risultato negativo attività potrebbe essere dovuto al enzima è espressa ad un livello basso. L'aggiunta di un tipo di cellula che può essere utilizzato come controllo positivo è opportuno garantire che unrisultato negativo non è legata a un problema tecnico e per aiutare con la risoluzione dei problemi. cellule epatiche primarie sono metabolicamente competenti e possono essere utilizzati come controllo, per esempio epatociti primari in sospensione sono molto facile da usare, ma la loro vitalità è limitato nel tempo. Linee di cellule epatiche sono possibili alternative che sono relativamente facili da usare come descritto in questo protocollo, ma alcuni sono migliori di altri in termini di attività metabolica 6, 21.
Poiché il saggio è non distruttiva, meno proteine totali è quantificato, è possibile seguire l'attività CYP nel tempo in studi longitudinali 20. Questo è un punto importante perché alcune cellule avranno attività di CYP variabile nel tempo in coltura. Un risultato negativo potrebbe essere associato con la mancanza di confluenza, progresso con la differenziazione o dedifferentiation in vitro. In tal caso, l'approccio è semi-QUANTITATIVAve poiché i dati non è normalizzata dalla quantità totale di proteina in ciascuna coltura cellulare. Non è sempre possibile o consigliabile riutilizzare il tessuto dopo la misurazione dell'attività CYP l'esposizione a sonde, inibitori o induttori possono avere un effetto tossico sul tessuto come avviene per TCDD.
frazioni cellulari come microsomi potrebbero anche essere utilizzati per caratterizzare l'attività CYP di un dato tipo di cellula. Microsome preparati, tuttavia, richiedono un sacco di materiale cellulare, l'aggiunta di cofattori adeguate e tampone per assicurare che gli enzimi rimangono attivi. Utilizzando cellule vive elimina la fase di preparazione microsome ingannevole e di lavoro fuori che buffer e cofattori funzionano meglio.
Come raccomandazione generale, è una pratica migliore per caratterizzare ulteriormente il profilo di espressione di CYP in colture cellulari per verificare che corrisponda l'attività enzimatica. Questo ulteriore livello di verifica è raccomandato dato che le sonde metaboliche non sono Enticontare specifico per un singolo CYP e dà maggiore fiducia che l'attività metabolica misurata corrisponde l'espressione dell'enzima corrispondente. Poiché CYP sono proteine di membrana sono relativamente difficili da preparare per western blot, quindi RT-PCR è stato l'approccio preferito al profilo questi enzimi 20.
È importante notare che questo protocollo descrive un metodo per attività enzimatica assay CYP che rappresenta solo una famiglia di enzimi metabolici, anche se importante. La flessibilità di un approccio spettrometria di massa permette lo sviluppo di metodi di acquisizione di altre trasformazioni metaboliche dei substrati sonda. Tuttavia, coloro che devono essere sviluppati, uno alla volta e ci sono attualmente meno noti sonde specifiche e inibitori selettivi per altre famiglie di enzimi metabolici. Questa distanza deve essere indirizzata a consentire una valutazione completa della competenza metabolica di cellule in vitro sisteSignorina.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Epithelix Sarl and Biopredic International for providing the airway cells and hepatic cells micrographies and Neil Smith for the figure illustrating the experimental procedure.
Reagent & Cells | |||
2 μm syringe filter | Whatman | UN203NPEORG | |
24 well plate | Corning | 3524 | |
4-methylumbelliferone | Sigma Aldrich | M1381 | |
5-phenyl pentyne | Sigma Aldrich | CD5001437 | |
6-hydroxybupropion | Sigma Aldrich | H3167 | |
6-hydroxychlorzoxazone | Sigma Aldrich | UC148 | |
7-ethoxycoumarin | Sigma Aldrich | 195642 | |
7-hydroxycoumarin | Sigma Aldrich | H24003 | |
8-methoxypsoralen | Sigma Aldrich | M3501 | |
acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
acetonitrile | Fisher | A/0626/17 | |
α-naphthoflavone | Sigma Aldrich | N5757 | |
BCA kit | Thermo Scientific | 23227 | |
b-glucuronidase/arylsulfatase | Sigma Aldrich | G0876 | |
Bupropion | Sigma Aldrich | B102 | |
Carbamazepine | Sigma Aldrich | C4024 | |
chlorzoxasone | Sigma Aldrich | C4397 | |
collagen | Cell Systems | 5005-B | |
coumarin | Sigma Aldrich | C4261 | |
disulfiram | Sigma Aldrich | 86720 | |
fluvoxamine | Sigma Aldrich | F2802 | |
Glutamax (Glutamine supplement) | Fisher | 35050061 | |
HepaRG metabolism supplement | Merck | MMAD621 | |
HepaRG thaw media supplement | Merck | MMADD671 | |
HepaRG | Merck | MMHPR116 | |
Luciferin-CEE | Promega | V8751 | |
methanol | Fisher | M/4056/17 | |
MucilAir airway cells | Epithelix | EP01 | |
MucilAir airway cells maintenance media | Epithelix | EP04MM | |
Phenomenex Kinetex 2.6μm, PFP 100A | Phenomenex | 00B-4477-AN | |
TCDD | Sigma Aldrich | 48599 | |
thioTEPA | Sigma Aldrich | T6069 | |
Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8µm 2.1 x 50mm | Waters | 86003538 | |
Williams’ E media | Fisher | 17704-024 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
UPLC | Waters | Acquity | |
QTRAP MS | Sciex | ABI Sciex 4000 | |
QTRAP MS software | Sciex | Analyst 1.4.2 | |
luminometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
cell counter | Beckman Coulter | Vi-Cell XR | |
rotary evaporator | Eppendorf | Eppendorf-5301 |