Bioluminesens Imaging av nevroinflammasjon i transgene mus etter Peripheral Inokulering av Alfa synukleinfibriller
Summary
Perifer injeksjon av alfa-synukleinfibriller i peritoneum eller tunge av Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus som uttrykker human alpha-synuclein med familiær A53T mutasjonen og ildflueluciferase, kan indusere neuropatologi, inkludert nevroinflammasjon , i deres sentralnervesystemet.
Abstract
For å studere prion-lignende oppførsel av misfoldet alpha-synuclein, blir musemodeller nødvendig for at muliggjøre rask og enkel overføring av alpha-synuclein prionoids, som forårsaker nevro innenfor sentralnervesystemet (CNS). Her beskriver vi at intraglossal eller intraperitoneal injeksjon av alfa-synukleinfibriller til bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus som overuttrykker humant alfa-synuclein med A53T mutasjon fra den prionprotein promoteren og ildflueluciferase fra promoteren for glialt fibrillært surt protein (GFAP), er tilstrekkelig til å indusere neuropathologic sykdom. I forhold til homozygot Tg (M83 + / +) mus som utvikler alvorlig nevrologiske symptomer som begynner ved en alder på 8 måneder, heterozygot Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) dyr forblir fri for spontan sykdom inntil de når en alder av 22 måneder. Interessant, injeksjon av alfa-synukleinfibriller via intraperitoneal rute indusert nevrologisk sykdom med lammelse i fire av fem Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus med en median inkubasjonstid på 229 ± 17 dager. Syke dyr viste alvorlige forekomster av fosforylert alfa-synuclein i hjernen og ryggmargen. Ansamlinger av alpha-synuclein ble sarkosyl-uløselig og colocalized med ubiquitin og p62, og ble fulgt av en inflammatorisk respons som resulterer i astrocytic gliosis og microgliosis. Overraskende, inokulering av alfa-synukleinfibriller inn i tungen var mindre effektivt til å forårsake sykdom med bare en av fem injiserte dyr som viser alpha-synuclein patologi etter 285 dager. Våre funn viser at vaksinasjonen via intraglossal rute og mer via intraperitonealt er egnet til å fremkalle nevrologisk sykdom med relevante kjennetegnene ved synukleinopatier i Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus. Dette gir en ny modell for å studere prion-lignende patogenesen indusered av alfa-synuclein prionoids i større detalj.
Introduction
Det er økende bevis for at alpha-synuclein har egenskaper som er lik de av prion-protein, spesielt i dens evne til selv-frø og forplanter misfolding mellom celler og langs nervebaner. Denne egenskapen av alfa-synuclein blir også referert til som 'prion-lignende' eller 'prionoid', og er støttet av observasjoner i transplantasjonsforsøk, noe som tyder transmissibilitet misfoldet alpha-synuclein fra syke neuroner til nylig transplantert friske nerveceller 1, 2 , 3, 4. Også direkte injeksjon av misfoldet alpha-synuclein inn i hjernen eller i periferien, f.eks bakbenområdet muskel eller tarmveggen, resulterer i en spredning av alfa-synuclein patologi for å distale deler av CNS 5, 6, 7, <sup class = "ekstern referanse"> 8, 9, 10. Vi analyserte overføring av alpha-synuclein prionoids via perifere ruter i mer detalj, og om spørsmålet hvorvidt misfoldet alpha-synuclein kan neuroinvade CNS etter en enkelt intraglossal eller intraperitoneal injeksjon, en funksjon som tidligere hadde blitt vist for prioner, men ikke for misfoldet alfa- synuclein. Etter injeksjon av prioner inn i tungen, blir neuroinvasion av CNS oppnås via forplantning langs hypoglossus nerve av tungen som fører til kjernen av hypoglossus nerve, som er lokalisert i hjernestammen 11. Som en musemodell valgte Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus som overuttrykker den A53T mutant av human alfa-synuclein fra prion-promoteren, og ildflueluciferase under kontroll av en promoter for å overvåke GFAP astrocytic aktivering av bioluminescens, som tidligere vist i hjernen hosprion-infiserte mus 12. I våre hender bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus ikke utvikler sykdommen før 23 måneders alder som har blitt vist av andre 13. En enkelt injeksjon av humane alfa-synukleinfibriller via intraglossal eller intraperitoneal vei indusert nevrologisk sykdom med patologi i hjernen og ryggmargen av Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus som støtter den hypotese at alpha-synuclein prionoids dele viktige egenskaper med prioner 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Perifer injeksjon av alfa-synukleinfibriller i peritoneum til Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus representerer en lettvint fremgangsmåte for å indusere nevrologisk sykdom ledsaget av nevroinflammasjon å rekapitulere viktige kjennetegn ved synukleinopatier. Tilsvarende, representerer tunge injeksjon annen rute for neuroinvasion av alfa-synuclein prionoids i transgene mus, men er mindre effektiv. Vi valgte å si opp våre forsøk på 420 dager etter injeksjon, og vi kan ikke utelukke at fler…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Olga Sharma, Theresa Hundt, og de ansatte på DZNE mikroskopi og dyre fasiliteter for teknisk støtte.
Materials
| anti-actin antibody | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anti-GFAP antibody | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| anti-Sequestosome-1 (p62) antibody | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anti-ubiquitin antibody [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamine | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xylazine | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27-gauge syringe | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Secureline lab marker | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin potassium salt | Acris | LK10000 | 30 mg/mL stock solution |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicator | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II imaging system | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice | The Jackson Laboratory | 004479 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | TLA-110 rotor | |
| Thickwall polycarbonate tubes | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP conjugated antibody | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 conjugated antibody | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Stella 3200 imaging system | Raytest | ||
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | SA/00216763/000500 | working solution 3% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | working dilution 1:50,000 |
| Fluoromount media | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | ||
| HALT protease and phosphatase inhibitors | Thermo Fisher Scientific | 10516495 | |
| Precellys 24-Dual homogenizer | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 10741395 | |
| Microtome RM2255 | Leica | ||
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss |
Referências
- Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T. B., Olanow, C. W. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson’s disease. Nat Med. 14 (5), 504-506 (2008).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson’s disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
- Hansen, C., et al. alpha-Synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells. J Clin Invest. 121 (2), 715-725 (2011).
- Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain. Brain. 136 (4), 1128-1138 (2013).
- Holmqvist, S., et al. Direct evidence of Parkinson pathology spread from the gastrointestinal tract to the brain in rats. Acta Neuropathol. 128 (6), 805-820 (2014).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1, 38 (2013).
- Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of alpha-synuclein induces CNS alpha-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10732-10737 (2014).
- Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
- Bartz, J. C., Kincaid, A. E., Bessen, R. A. Rapid prion neuroinvasion following tongue infection. J Virol. 77 (1), 583-591 (2003).
- Tamgüney, G., et al. Measuring prions by bioluminescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 15002-15006 (2009).
- Watts, J. C., et al. Transmission of multiple system atrophy prions to transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (48), 19555-19560 (2013).
- Breid, S., et al. Neuroinvasion of alpha-Synuclein Prionoids after Intraperitoneal and Intraglossal Inoculation. J Virol. 90 (20), 9182-9193 (2016).
- Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).
- Zhu, L., et al. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci Lett. 367 (2), 210-212 (2004).
- Bernis, M. E., et al. Prion-like propagation of human brain-derived alpha-synuclein in transgenic mice expressing human wild-type alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 3 (1), 75 (2015).
- Gunther, R., et al. Clinical testing and spinal cord removal in a mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS). J Vis Exp. (61), (2012).
- Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson’s disease. Nat Protoc. 2 (1), 141-151 (2007).
- Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
- Kim, C., et al. Exposure to bacterial endotoxin generates a distinct strain of alpha-synuclein fibril. Sci Rep. 6, 30891 (2016).
- Keller, A. F., Gravel, M., Kriz, J. Live imaging of amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: disease onset is characterized by marked induction of GFAP in Schwann cells. Glia. 57 (10), 1130-1142 (2009).
- Stöhr, J., et al. Distinct synthetic Abeta prion strains producing different amyloid deposits in bigenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209 (5), 975-986 (2012).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. 75 (3), 351-362 (2014).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1 (1), 38 (2013).
- Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
