Imagem de bioluminescência de Neuroinflammation em Ratinhos Transgénicos Após inoculação periférica de alfa-sinucleína fibrilas
Summary
Injecção periférica de fibrilas-sinucleína alfa no peritoneu ou língua de Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratos, que expressam alfa-sinucleína humana com a mutação A53T familiar e a luciferase do pirilampo, pode induzir a neuropatologia, incluindo neuroinflamao , em seu sistema nervoso central.
Abstract
Para estudar o comportamento de prião de tipo de enrolamento incorrecto alfa-sinucleína, são necessários modelos de murganho que permite a transmissão rápida e simples de prionoids alfa-sinucleína, que causam neuropatologia no interior do sistema nervoso central (SNC). Aqui descrevemos que intraglossal ou injecção intraperitoneal de fibrilas-sinucleína em alfa bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratos, que sobre-expressam alfa-sinucleína humana com a mutação A53T a partir do promotor da proteína prião e a luciferase do pirilampo de o promotor para a proteína ácida fibrilar glial (GFAP), é suficiente para induzir doença neuropatológica. Em comparação com Tg homozigótica (M83 + / +) ratinhos que desenvolvem sintomas neurológicos graves começam com uma idade de 8 meses, heterozigótica Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) animais permanecem livres da doença espontânea até atingirem um idade de 22 meses. Interessantemente, a injeco de fibrilas-sinucleína alfa através da intraperitoneal rota induzida doença neurológica com paralisia em quatro de cinco Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratos com um tempo de incubação médio de 229 ± 17 dias. animais doentes mostrou depósitos graves de fosforilada alfa-sinucleína em seus cérebros e medulas espinhais. Acumulações de alfa-sinucleína foram sarcosil-insolúvel e co-localizada com ubiquitina e p62, e foram acompanhados por uma resposta inflamatória que resulta em gliose de astrócitos e microgliose. Surpreendentemente, a inoculação de fibrilas-sinucleína alfa para a língua era menos eficaz em causar doença com apenas um dos cinco animais injectados mostrando alfa-sinucleína patologia após 285 dias. Nossos resultados mostram que a inoculação por via intraglossal e mais ainda através da via intraperitoneal é adequado para induzir doença neurológica com características relevantes da sinucleinopatias em Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) camundongos. Isto fornece um novo modelo para estudar prion-como patogênese induzird por prionoids alfa-sinucleína em maior detalhe.
Introduction
Existe evidência crescente de que o alfa-sinucleína tem características que são semelhantes às da proteína prião, em particular na sua capacidade de se auto-propagam semente e enrolamento incorrecto entre as células e ao longo de caminhos neuronais. Esta propriedade de alfa-sinucleína é também referido como 'prião de tipo' ou 'prionoid', e é suportada por observações em experiências de transplantação, o que sugere a transmissibilidade do enrolamento incorrecto alfa-sinucleína a partir de neurónios doentes para recém-transplantados neurónios saudáveis 1, 2 , 3, 4. Também injecção directa de enrolamento incorrecto alfa-sinucleína no cérebro ou da periferia, por exemplo, o músculo do membro posterior ou parede intestinal, resulta numa disseminação da patologia alfa-sinucleína a partes distais do SNC 5, 6, 7, <sup class = "xref"> 8, 9, 10. Analisou-se a transmissão de prionoids alfa-sinucleína por vias periféricas em mais detalhe e dirigiu-se à questão de saber se misfolded alfa-sinucleína pode neuroinvade do SNC após uma única injecção intraperitoneal ou intraglossal, uma característica que tinha sido previamente demonstrado para priões, mas não para alfa- misfolded sinucleína. Após a injecção de priões para a língua, neuroinvasão do SNC é alcançada através de propagação ao longo do nervo hipoglosso da lingueta que conduz para o núcleo do nervo hipoglosso, que está localizado no tronco cerebral 11. Como um modelo de ratinho que escolheu Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) murganhos que sobre-expressam o mutante A53T de alfa-sinucleína humano a partir do promotor do prião, e luciferase de pirilampo sob o controlo de um promotor GFAP para monitorizar a activação de astrócitos pela bioluminescência, como mostrado anteriormente no cérebro deprião-infectados ratinhos 12. Em nossas mãos bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratos não desenvolveram a doença até 23 meses de idade, como tem sido demonstrado por outros 13. Uma única injecção de fibrilas-sinucleína alfa humanos através da rota ou intraglossal induzida doença neurológica intraperitoneal com patologia nos cérebros e medulas espinhais de Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) murganhos que suportam a hipótese de que prionoids alfa-sinucleína compartilham características importantes com priões 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Injecção periférica de fibrilas-sinucleína alfa no peritoneu de Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratinhos representa um método fácil para induzir a doença neurológica acompanhada por neuroinflamao recapitular características importantes de sinucleinopatias. Da mesma forma, a injecção língua representa uma outra via para neuroinvasão por prionoids alfa-sinucleína em ratinhos transgénicos, mas é menos eficiente. Escolhemos para terminar nossas experiências em 420 dias após a inj…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem Olga Sharma, Theresa Hundt, e os funcionários das microscopia e animais instalações DZNE para suporte técnico.
Materials
| anti-actin antibody | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anti-GFAP antibody | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| anti-Sequestosome-1 (p62) antibody | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anti-ubiquitin antibody [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamine | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xylazine | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27-gauge syringe | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Secureline lab marker | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin potassium salt | Acris | LK10000 | 30 mg/mL stock solution |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicator | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II imaging system | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice | The Jackson Laboratory | 004479 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | TLA-110 rotor | |
| Thickwall polycarbonate tubes | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP conjugated antibody | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 conjugated antibody | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Stella 3200 imaging system | Raytest | ||
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | SA/00216763/000500 | working solution 3% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | working dilution 1:50,000 |
| Fluoromount media | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | ||
| HALT protease and phosphatase inhibitors | Thermo Fisher Scientific | 10516495 | |
| Precellys 24-Dual homogenizer | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 10741395 | |
| Microtome RM2255 | Leica | ||
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss |
Referências
- Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T. B., Olanow, C. W. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson’s disease. Nat Med. 14 (5), 504-506 (2008).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson’s disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
- Hansen, C., et al. alpha-Synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells. J Clin Invest. 121 (2), 715-725 (2011).
- Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain. Brain. 136 (4), 1128-1138 (2013).
- Holmqvist, S., et al. Direct evidence of Parkinson pathology spread from the gastrointestinal tract to the brain in rats. Acta Neuropathol. 128 (6), 805-820 (2014).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1, 38 (2013).
- Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of alpha-synuclein induces CNS alpha-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10732-10737 (2014).
- Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
- Bartz, J. C., Kincaid, A. E., Bessen, R. A. Rapid prion neuroinvasion following tongue infection. J Virol. 77 (1), 583-591 (2003).
- Tamgüney, G., et al. Measuring prions by bioluminescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 15002-15006 (2009).
- Watts, J. C., et al. Transmission of multiple system atrophy prions to transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (48), 19555-19560 (2013).
- Breid, S., et al. Neuroinvasion of alpha-Synuclein Prionoids after Intraperitoneal and Intraglossal Inoculation. J Virol. 90 (20), 9182-9193 (2016).
- Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).
- Zhu, L., et al. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci Lett. 367 (2), 210-212 (2004).
- Bernis, M. E., et al. Prion-like propagation of human brain-derived alpha-synuclein in transgenic mice expressing human wild-type alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 3 (1), 75 (2015).
- Gunther, R., et al. Clinical testing and spinal cord removal in a mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS). J Vis Exp. (61), (2012).
- Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson’s disease. Nat Protoc. 2 (1), 141-151 (2007).
- Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
- Kim, C., et al. Exposure to bacterial endotoxin generates a distinct strain of alpha-synuclein fibril. Sci Rep. 6, 30891 (2016).
- Keller, A. F., Gravel, M., Kriz, J. Live imaging of amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: disease onset is characterized by marked induction of GFAP in Schwann cells. Glia. 57 (10), 1130-1142 (2009).
- Stöhr, J., et al. Distinct synthetic Abeta prion strains producing different amyloid deposits in bigenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209 (5), 975-986 (2012).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. 75 (3), 351-362 (2014).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1 (1), 38 (2013).
- Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
