Analyse van proteïnekinaseactiviteit met radiolabelde ATP
Summary
Proteïne kinasen zijn hoog geëvolueerde signaal enzymen en steigers die kritisch zijn voor inter- en intracellulaire signaaltransductie. Wij presenteren een protocol voor het meten van kinase-activiteit door middel van radioactief gemerkte adenosintrifosfaat ([γ-32P] ATP), een betrouwbare methode om te helpen bij het ophelderen van cellulaire signalering regulering.
Abstract
Proteïne kinasen zijn in staat om grote cellulaire veranderingen te regelen in reactie op complexe arrays van stimuli, en veel inspanning is gericht op het onthullen van allosterische details van hun regulering. Kinases omvatten signaleringsnetwerken waarvan de gebreken vaak kenmerken van meerdere vormen van kanker en aanverwante ziekten, waardoor een assayplatform wordt gemaakt dat manipulatie van stroomopwaartse regulerende factoren kan manipuleren en validatie van reactievereisten die kritisch zijn bij het zoeken naar verbeterde therapeutica. Hier beschrijven we een basische kinase-analyse die gemakkelijk kan worden aangepast om specifieke experimentele vragen aan te passen, waaronder maar niet beperkt tot het testen van de effecten van biochemische en farmacologische middelen, genetische manipulaties zoals mutatie en deletie, evenals celcultuuromstandigheden en behandelingen om te probeeren Cel signalering mechanismen. Deze analyse maakt gebruik van radiomerkte [γ-32P] ATP, waarmee kwantitatieve vergelijkingen en duidelijke visualisatie van resultaten mogelijk zijnIngevuld voor gebruik met immunoprecipitated of recombinant kinase, specifieke of typische substraten, over een breed scala van reactieomstandigheden.
Introduction
Proteïne kinasen zijn geavanceerde enzymen die kritiek zijn voor de transmissie van cellulaire signalen in passende responsen 1 . Gezien hun rol in het behoud van homeostase en het voorkomen of bevorderen van ziektestaten 2 , zijn biochemische methoden voor het beoordelen van kinase-activiteit nog steeds krachtige instrumenten om de details van eukaryotische signalering 3 te definiëren. Hoewel strategieën die fosfo-specifieke antilichamen gebruiken, zeer informatief zijn in termen van het meten van de effecten van verschillende behandelingsomstandigheden op cel signaleringsstatus 4 , kan een kinase-analyse de effecten van verschillende behandelingsomstandigheden rechtstreeks meten aan de enzymatische activiteit van een kinase van interesseren. Hoewel er verschillende opties zijn voor vergelijkbare analyses die geen radioactieve materialen gebruiken 5 , blijven we vertrouwen op deze methode voor een robuuste kwantificering van de resultaten. ErZijn twee typische toepassingen van deze test, beide waardevol om verschillende redenen: de immunoprecipitated (IP) kinase assay ( Figuur 1 ) en de recombinant proteïne kinase assay ( Figuur 2 ).
De IP-kinase-analyse is enorm nuttig voor het identificeren van factoren die in staat zijn specifieke proteïne kinasen te activeren, evenals het meten van remmende remmende behandelingsomstandigheden. In het kort wordt een epitoopgemerkte kinase van belang getransfecteerd in gekweekte eukaryote cellen, onderworpen aan een verscheidenheid aan behandelingen, immunoprecipitated, en geanalyseerd voor het vermogen om radioactief gemerkte fosfaat in een model substraat ( bv. Myelin basis eiwit (MBP)) op te nemen. IP-kinase-analyse kan ook worden uitgevoerd zonder overexpressie toe te passen, hetzij door immunoprecipitatie van endogeen eiwit of een aantal genoom-bewerkende technieken. Omdat behandelingen in cultuur worden toegediend, kan deze methode stimulaties detecteren die door meerdere upstream-factoren worden overgedragenOf parallelle wegen door in vitro uitlezing. Een belangrijk voordeel van deze methode is dat het geen voorafgaande kennis vereist van directe stroomopwaartse of stroomafwaartse factoren of fosforyleringsplaatsen daarin. Bovendien, zodra specifieke substraten voor een kinase van belang zijn geïdentificeerd, kan hetzelfde kinase assay protocol gebruikt worden met recombinante componenten om specifieke activiteit te meten aan natuurlijke substraten en specifieke fosforyleringsplaatsen te identificeren wanneer gecombineerd met massaspectrometrie analyse. Sites die op deze wijze worden geïdentificeerd, kunnen verder worden gevalideerd met kinase-analyses die substraatmutanten gebruiken. Ten slotte kan deze methode ook worden gebruikt om autofosforylering te detecteren en te meten.
Het hierin gegeven protocol veronderstelt ofwel een geoptimaliseerde eiwitzuiveringsschema of transfectie methode voor het uitdrukken van een affiniteit gemarkeerde kinase van belang in gekweekte cellen. Voor meer gedetailleerde exposities van transfectie, lysis, immunoprecipitatie en eiwitzuivering protOcols, wij raden aan te verwijzen naar Cold Spring Harbor Protocols 6 . Voor meer informatie over testontwikkeling en -verandering, verwijzen wij u naar Proteïnefosforylering: Geselecteerde Methoden in Enzymologie 7 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Kinases zijn een uiteenlopende familie van eiwitten die in talrijke contexten uitgebreide functionaliteit hebben ontwikkeld, en kinase-analyses zijn ongelooflijk bruikbaar bij het bestuderen van verschillende signalering eiwitten en hebben veel bijgedragen aan ons huidige begrip van cellulaire communicatie. In het bijzonder werd dezelfde basisassay gebruikt om twee disparate kinasen te karakteriseren ondanks grote verschillen in structuur en activiteit. WNK1 kinase bevat een atypische katalytische zak waar het kritische…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken alle huidige en voormalige leden van het Cobb laboratorium voor waardevol werk en discussies, en Dionne Ware voor administratieve bijstand. Deze studies werden ondersteund door National Institutes of Health Grant R37 DK34128 en Welch Foundation Grant I1243 aan MHC
Materials
| Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0963-03 |
| Radiolabeled [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG035C010MC |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610737 |
| Radioactive shielding | Research Products International | BR-006 |
| R-250 dye (Coomassie) | Thermo Fisher | 20278 |
| Whatman Grade 3 qualitative filter paper | Whatman | 1003-917 |
| Slab gel vacuum dryer | Bio-Rad | Model 583 Gel Dryer #1651745 |
| Autorad marker | Agilent Technologies | 420201 |
| Phosphorescent ruler | Sigma Aldrich | R8133 |
| Phosphorescent dots | Sigma Aldrich | L5149 |
| Geiger counter | Ludlum | Model 3 with 44-9 detector |
| BioMax Cassette 8×10" | Carestream Health | 107 2263 |
| BioMax MS Film 8×10" | Carestream Health | 829 4985 |
| BioMax MS Intensifying Screen 8×10" | Carestream Health | 851 8706 |
| Medical/X-ray film processor | Konica Minolta | SRX-101A |
| Scintillation vials | Research Products International | 125500 |
| Scintillation fluid | MP Biomedicals | 188245305 |
| Beckman LS 6500 Scintillation counter | Beckman | LS 6500 |
Referências
- Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
- Wellbrock, C., Arozarena, I. The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer. Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).
- Yang, T., Terman, J. R. Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins. Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).
- Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases. Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).
- Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction. Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).
- Dalby, K. N. Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology. J Am Chem Soc. 121 (51), 12215 (1999).
- . Autoradiography Available from: https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography (2011)
- Walker, J. M. . The Protein Protocols Handbook. , (2009).
- Xu, B. WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II. J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).
- McReynolds, A. C. Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding. Bioquímica. 55 (12), 1909-1917 (2016).
- Carlson, S. M. Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3. Sci Signal. 4 (196), rs11 (2011).
- Courcelles, M. Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions. Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).
- Myers, S. M. High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors. ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).
