As cinases de proteínas são altamente evoluídas sinalizando enzimas e andaimes que são críticos para a transdução de sinal inter e intracelular. Nós apresentamos um protocolo para medir a atividade de quinase através do uso de adenosina trifosfato radiomarcado ([γ- 32 P] ATP), um método confiável para auxiliar na elucidação da regulação da sinalização celular.
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Artigo de método
Ensaio da Actividade da Proteína Quinase com ATP Radiomarcado
Neste artigo
Resumo
Resumo
As cinases proteicas são capazes de governar mudanças celulares em grande escala em resposta a complexas matrizes de estímulos, e muito esforço tem sido direcionado para descobrir detalhes alostéricos de sua regulação. As quinases compreendem redes de sinalização cujos defeitos são frequentemente marcas de múltiplas formas de cancro e doenças relacionadas, tornando uma plataforma de análise passível de manipulação de factores reguladores a montante e validação de requisitos de reacção críticos na procura de terapêuticas melhoradas. Aqui, descrevemos um ensaio de quinase básico que pode ser facilmente adaptado para se adequar a questões experimentais específicas incluindo, mas não se limitando a, testar os efeitos de agentes bioquímicos e farmacológicos, manipulações genéticas tais como mutação e deleção, bem como condições de cultura de células e tratamentos para sondar Mecanismos de sinalização celular. Este ensaio utiliza [γ- 32 P] ATP radiomarcado, que permite comparações quantitativas e uma visualização clara dos resultados, e pode ser modSe para utilização com quinase imunoprecipitada ou recombinante, substratos específicos ou tipificados, numa vasta gama de condições de reacção.
Introdução
As cinases de proteínas são sofisticadas enzimas críticas para a transmissão de sinais celulares em respostas apropriadas 1 . Dado o seu papel na manutenção da homeostase e na prevenção ou promoção de estados de doença 2 , os métodos bioquímicos para avaliar a actividade de quinase continuam a ser ferramentas poderosas para delinear as particularidades da sinalização eucariótica 3 . Embora as estratégias que utilizam anticorpos fosfo específicos tenham sido altamente informativas em termos de medição dos efeitos de diferentes condições de tratamento no estado de sinalização celular
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Protocolo
1. Kinase Recursos de Purificação e General Immunoprecipitation Pipeline
NOTA: As quinases para utilização com este ensaio podem ser obtidas a partir de imunoprecipitados de células cultivadas ou por meios recombinantes tais como a purificação marcada por afinidade 6 . Abaixo está um protocolo geral para a imunoprecipitação marcada por sinalização que pode ter de ser modificada dependendo da quinase de interesse. Tudo deve ser mantido em gelo quando possível.
- Adicionar 2 μL de 1 mg / mL de anticorpo a 200 μL de lisados celulares (geralmente ~ 1 mg / mL de concentração total de proteína) e incubar a 4 °....
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Resultados
Ensaios de quinase WNK1 IP
O WNK1 marcado com Myc foi transfectado em células HEK293 e imunoprecipitado com um anticorpo anti-Myc 11 . O imunoprecipitado exibiu actividade quinase em direcção ao substrato modelo MBP assim como para si próprio ( Figura 1A ). Os mutantes WNK1 foram então testados quanto à actividade de quinase em relação a MBP pelo mesmo método, desta vez empregando construç.......
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Discussão
As quinases são uma família diversificada de proteínas que desenvolveram extensa funcionalidade em numerosos contextos e os ensaios de quinase têm sido extremamente úteis no estudo de várias proteínas de sinalização e têm contribuído muito para a nossa compreensão atual da comunicação celular. Notavelmente, o mesmo ensaio básico foi utilizado na caracterização de duas cinases diferentes, apesar das grandes diferenças de estrutura e actividade. A quinase WNK1 contém uma bolsa catalítica atípica em que a lisina crítica se.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores agradecem a todos os atuais e antigos membros do laboratório Cobb pelo valioso trabalho e discussões, e Dionne Ware pela assistência administrativa. Estes estudos foram apoiados pelo National Institutes of Health Grant R37 DK34128 e Welch Foundation Grant I1243 para MHC
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Proteína A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0963-03 | |
| Radiomarcado [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG035C010MC | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610737 | |
| Blindagem radioativa | Products International | BR-006 | |
| R-250 corante (Coomassie) | Thermo Fisher | 20278 | |
| Whatman Grau 3 papel de filtro qualitativo Whatman | 1003-917 | ||
| Secador de gel a vácuo de placa | Bio-Rad | Modelo 583 #1651745 | |
| Marcador Autorad | Agilent Technologies | 420201 | |
| Régua fosforescente | Sigma Aldrich | R8133 | |
| Pontos fosforescentes | Sigma Aldrich | L5149 | |
| Contador Geiger | Ludlum | Model 3 com detector | |
| BioMax 8 x 10" | Carestream Health | 107 2263 | |
| BioMax Filme MS 8" x 10" | Carestream Health | 829 4985 | |
| BioMax MS Tela Intensificadora 8" x 10" | Carestream Health | 851 8706 | |
| Processador de filme médico/raio-X | Konica Minolta | SRX-101A | |
| Frascos de cintilação | Research Products International | 125500 | |
| MP | Biomedicals | 188245305 | |
| Beckman LS 6500 Contador de cintilação | Beckman | LS 6500 |
Referências
- Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
- Wellbrock, C., Arozarena, I. The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer. Front Cell Dev Biol. 4....
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Reimpressões e permissões
