איתור הביטוי microRNA בממברנה פריטוניאלית של חולדות באמצעות כמותי בזמן אמת PCR
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי ביטוי microRNA ב קרום עכברוש עכברוש באמצעות כמותי בזמן אמת הפוכה תעתיק התגובה שרשרת פולימראז. שיטה זו מתאימה ללימוד פרופיל הביטוי microRNA בקרום עכברוש עכברוש במספר תנאים פתולוגיים.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) הם RNAs noncoding קטנים המווסת את הביטוי RNA שליח הודעה שלאחר transcriptionally. פרופיל הביטוי miRNA נחקרה באיברים ורקמות שונים בעכברוש. עם זאת, שיטות סטנדרטיות לטיהור miRNAs וזיהוי הביטוי שלהם בממברנה פריטוניאלית עכברוש לא היו מבוססים היטב. פיתחנו שיטה יעילה ואמינה לטהר לכמת miRNAs באמצעות כמותי בזמן אמת הפוכה תעתיק התגובה שרשרת פולימראז (qRT-PCR) בממברנה פריטוניאלית עכברוש. פרוטוקול זה מורכב של ארבעה שלבים: 1) טיהור מדגם קרום פריטוניאלי; 2) טיהור של RNA הכולל כולל מירנה מדגם הממברנה פריטוניאלית; 3) שעתוק לאחור של מירנה לייצר cDNA; ו 4) qRT-PCR כדי לגלות ביטוי מירנה. באמצעות פרוטוקול זה, קבענו בהצלחה כי הביטוי של miRNAs שישה (מירנה -142-3p, מירנה 21-5p, מירנה-221-3p, מירנה-223-3p, מירנה -327, ו- miRNA-34a-5p) גדלבאופן מובהק בממברנה הצפקית של מודל חולשת הצפק של העכברוש בהשוואה לאלו בקבוצת הביקורת. פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי ללמוד את הפרופיל של ביטוי מירנה בקרום הצפק של חולדות בתנאים פתולוגיים רבים.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) הם קצרים, RNAs לא קידוד כי שלאחר transcriptionally לווסת את השליח RNA (mRNA) ביטוי 1 . שינויים בביטוי של miRNAs להסדיר את הביטוי של mRNAs רבים אשר ממלאים תפקידים מרכזיים במצבים פתולוגיים שונים, כולל סרטן, דלקות, הפרעות מטבוליות, ו פיברוזיס 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . לכן, miRNAs יש פוטנציאל כמו ביומרקרים חדשים ומטרות טיפוליות 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . פרופיל הביטוי miRNA נקבע בעכברוש שוניםאיברים ורקמות, כולל כבד, לב, ריאה וכליות. עם זאת, שיטות סטנדרטיות לטיהור וזיהוי של miRNAs בממברנה פריטוניאלית עכברוש לא היו מבוססים היטב.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא בהצלחה לטהר ולזהות miRNAs בממברנה פריטוניאלית עכברוש. ראשית, מדגם הממברנה הצפק היה homogenized באמצעות homogenizer זכוכית, ואחריו חשיפה למערכת biopolymer רטוש בעמודה microcentrifuge ספין 10 . לאחר מכן, סך כולל RNA כולל miRNA היה מטוהרים מדגם הממברנה פריטוניאלית באמצעות עמודה סיליקה מבוסס קרום סיליקה 10 . לאחר מכן, cDNA היה מסונתז מן RNA סך מטוהרים באמצעות transcriptase הפוך, פולימראז פולי (A), ו אוליגו dT תחל 11 . לבסוף, הביטוי של מירנה נקבע על ידי qRT-PCR באמצעות צבע intercalating 11 . הרציונל של פרוטוקול זה הוא בכמו על מחקרים קודמים שהראו טיהור משמעותי וזיהוי של מירנה ברקמות על ידי תהליך פשוט 8 , 10 , 11 . זה כבר דיווח כי השימוש במערכת biopolymer-רטוש בעמודה microcentrifuge ספין סיליקה קרום מבוסס ספין טור יכול לטהר באיכות גבוהה RNA סך מ רקמות 10 . השיטה של סינתזה cDNA מ RNA סך מטוהרים באמצעות transcriptase הפוך, פולימראז פולי (א), ו אוליגו dT תחל, ואת השיטה של גילוי ביטוי מירנה על ידי qRT-PCR באמצעות צבע intercalating בפרוטוקול זה דווחו כדי להראות דיוק גבוהה רגישות 11 . בנוסף, זהו תהליך פשוט, אשר חוסך זמן ומונע שגיאות טכניות. לכן, פרוטוקול זה שימושי במחקרים הדורשים זיהוי מדויק ורגיש מאוד של מירנה בממברנה פריטוניאלית עכברוש במגוון רחב של תנאים פתולוגיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
באמצעות פרוטוקול המוצג בכתב היד הזה, miRNAs בקרום עכברוש עכברוש טוהרו בהצלחה זוהה באמצעות qRT-PCR. האמינות של ניתוח נתונים qRT-PCR תלוי באיכות של miRNAs מטוהרים. לכן, טוהר miRNAs ניתן לבדוק לפני qRT-PCR על ידי היחס של ספיגת ב 260 ננומטר לזה ב 280 ננומטר, אשר ניתן למדוד באמצעות ספקטרופוטומטר….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות Miyako Shigeta על התמיכה הטכנית שלה מעולה. עבודה זו נתמכה חלקית על ידי JSPS KAKENHI (מענק מספר 25461252).
Materials
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
| miRNA-142-3p primer | Qiagen | MS00031451 | 5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3' |
| miRNA-21-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3' |
| miRNA-221-3p primer | Qiagen | MS00003857 | 5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3' |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00033320 | 5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3' |
| miRNA-34a-5p primer | Qiagen | MS00003318 | 5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3' |
| miRNA-327 primer | Qiagen | MS00000805 | 5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3' |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| methylglyoxal | Sigma-Aldrich | M0252 | |
| Midperic | Terumo | not assign | peritoneal dialysis fluid |
| Sprague–Dawley rats | SLC | not assign |
Referências
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).
- Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).
- Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).
- Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
- Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem Biophys Res Commun. , (2015).
- Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
- Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. J Surg Oncol. , (2015).
- Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Transl Res. 169, 47-66 (2016).
- Minami, K., et al. miRNA expression atlas in male rat. Sci Data. 1, 140005 (2014).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. Pathophysiology of peritoneal membrane failure. Perit Dial Int. 20, S22-S42 (2000).
- Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N. The pathophysiology of the peritoneal membrane. J Am Soc Nephrol. 21 (7), 1077-1085 (2010).
- Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).
- Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR — how well do they correlate?. BMC Genomics. 6, 59 (2005).
- Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data–is it really necessary?. Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).
