Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR Kullanarak Sıçanların Periton Membranındaki MikroRNA İfadesinin Saptanması
Summary
Burada, kantitatif gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak sıçan peritoneal membranda mikroRNA ekspresyonunun saptanması için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, çeşitli patolojik koşullardaki sıçan peritoneal membrandaki mikroRNA ekspresyon profilini incelemek için uygundur.
Abstract
Mikro RNA'lar (miRNA'lar), transkripsiyonel olarak haberci RNA ekspresyonunu düzenleyen küçük kod çözücü olmayan RNA'lardır. Sıçanlardaki çeşitli organ ve dokulardaki miRNA ekspresyon profili araştırılmıştır. Bununla birlikte, miRNA'ların saflaştırılması ve fare peritoneal membrandaki ekspresyonlarının saptanması için standart yöntemler iyi belirlenmemiştir. Rat peritoneal membranda kantitatif gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) kullanarak miRNA'ları arındırmak ve ölçmek için etkili ve güvenilir bir yöntem geliştirdik. Bu protokol dört aşamadan oluşur: 1) peritoneal membran numunesinin saflaştırılması; 2) peritoneal membran örneğinden miRNA da dahil olmak üzere toplam RNA'nın saflaştırılması; 3) cDNA üretmek için miRNA'nın ters transkripsiyonu; Ve 4) miRNA ekspresyonunu saptamak için qRT-PCR. Bu protokolü kullanarak altı miRNA (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 ve miRNA-34a-5p) ekspresyonunun arttığını başarıyla tespit ettikSıçan peritoneal fibroz modelinin peritoneal zarında kontrol gruplarına kıyasla belirgin olarak anlamlı bir farklılık göstermedi. Bu protokol, birçok patolojik koşulda sıçanların peritoneal zarındaki miRNA ekspresyon profilini incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Mikro RNA'lar (miRNA'lar), haberci RNA (mRNA) ekspresyonunu transkripsiyonel olarak düzenleyen kısa, kodlamayan RNA'lardır. MiRNA'ların ekspresyonundaki değişiklikler, kanser, inflamasyon, metabolik bozukluklar ve fibroz 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 dahil olmak üzere çeşitli patolojik koşullarda önemli rol oynayan birçok mRNA'nın ekspresyonunu düzenler. Bu nedenle, miRNA'lar yeni biyolojik belirteçler ve terapötik hedefler olarak potansiyele sahiptir 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . MiRNA ifade profili, çeşitli sıçanlardaKaraciğer, kalp, akciğer ve böbrek dahil olmak üzere organ ve dokular 9 . Bununla birlikte, sıçan peritoneal membrandaki miRNA'ların saflaştırılması ve bulgulanması için standart yöntemler iyi belirlenmemiştir.
Bu protokolün genel amacı sıçan periton zarında bulunan miRNA'ları başarılı bir şekilde arındırmak ve tespit etmektir. İlk önce, bir cam homojenleştirici kullanılarak periton zar numunesi homojenleştirildi ve ardından bir mikrosantrifüj spin kolonu 10'da bir biyopolimer parçalama sistemine maruz bırakıldı. Daha sonra, miRNA da dahil olmak üzere toplam RNA, bir silika-zar-esaslı döndürme kolonu 10 kullanılarak peritoneal membran örneğinden saflaştırılmıştır. Ardından, cDNA, ters transkriptaz, poli (A) polimeraz ve oligo-dT primer 11 kullanılarak saflaştırılmış toplam RNA'dan sentezlendi. Sonunda, miRNA ifadesi bir interkalasyon boya 11 kullanılarak qRT-PCR ile belirlendi. Bu protokolün mantığı bDokulardaki miRNA'yı basit bir işlem 8 , 10 , 11 ile belirgin saflaştırma ve saptamayı gösteren önceki çalışmalara dayandırılmıştır. Mikro santrifüj spin kolonu ve silis-membran tabanlı spin sütununda bir biyopolimer parçalama sisteminin kullanılmasının dokulardan 10 yüksek kaliteli toplam RNA'yı arındırabildiği bildirilmiştir. Ters transkriptaz, poli (A) polimeraz ve oligo-dT primer kullanılarak saflaştırılmış toplam RNA'dan cDNA sentezleme yöntemi ve bu protokolde interkalasyon boyası kullanılarak qRT-PCR ile miRNA ekspresyonunu saptama yöntemi, yüksek doğruluk ve Duyarlılık 11 . Buna ek olarak, bu zaman kazandıran ve teknik hatayı önleyen basit bir işlemdir. Bu nedenle, bu protokol, geniş bir patolojik koşul aralığında sıçan peritoneal membranda yüksek oranda hassas ve hassas bir şekilde tespit edilmesini gerektiren çalışmalarda yararlıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu el yazmasında sunulan protokol kullanılarak sıçan peritoneal zardaki miRNA'lar başarılı bir şekilde saflaştırıldı ve qRT-PCR kullanılarak tespit edildi. QRT-PCR veri analizinin güvenilirliği, saflaştırılmış miRNA'ların kalitesine bağlıdır. Dolayısıyla, miRNA'ların saflığı, bir spektrofotometre kullanılarak ölçülebilen 260 nm'de absorbansa 280 nm'de absorbansa oranla qRT-PCR'den önce kontrol edilebilir. MiRNA'nın anlamlı amplifikasyonu qRT-PCR kullanıla…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mükemmel teknik desteği için Miyako Shigeta'ya teşekkür etmek isteriz. Bu çalışma kısmen JSPS KAKENHI tarafından desteklenmiştir (hibe numarası 25461252).
Materials
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
| miRNA-142-3p primer | Qiagen | MS00031451 | 5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3' |
| miRNA-21-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3' |
| miRNA-221-3p primer | Qiagen | MS00003857 | 5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3' |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00033320 | 5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3' |
| miRNA-34a-5p primer | Qiagen | MS00003318 | 5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3' |
| miRNA-327 primer | Qiagen | MS00000805 | 5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3' |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| methylglyoxal | Sigma-Aldrich | M0252 | |
| Midperic | Terumo | not assign | peritoneal dialysis fluid |
| Sprague–Dawley rats | SLC | not assign |
Referências
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).
- Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).
- Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).
- Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
- Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem Biophys Res Commun. , (2015).
- Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
- Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. J Surg Oncol. , (2015).
- Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Transl Res. 169, 47-66 (2016).
- Minami, K., et al. miRNA expression atlas in male rat. Sci Data. 1, 140005 (2014).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. Pathophysiology of peritoneal membrane failure. Perit Dial Int. 20, S22-S42 (2000).
- Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N. The pathophysiology of the peritoneal membrane. J Am Soc Nephrol. 21 (7), 1077-1085 (2010).
- Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).
- Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR — how well do they correlate?. BMC Genomics. 6, 59 (2005).
- Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data–is it really necessary?. Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).
