Detektion av mikroRNA-uttryck i peritonealt membran hos råttor med användning av kvantitativ realtids-PCR
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för detektering av mikroRNA-uttryck i rått-peritonealt membran med användning av kvantitativ omvänd transkriptions-polymeras kedjereaktion i realtid. Denna metod är lämplig för studier av mikroRNA-expressionsprofilen i råttor-peritonealt membran i flera patologiska tillstånd.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) är små icke-kodande RNA som reglerar Messenger RNA-uttryck efter transskriptionellt. MiRNA-expressionsprofilen har undersökts i olika organ och vävnader i råtta. Standardmetoder för rening av miRNA och detektering av deras uttryck i råttor peritonealt membran har emellertid inte varit väl etablerade. Vi har utvecklat en effektiv och tillförlitlig metod för att rena och kvantifiera miRNAs med hjälp av kvantitativ omvänd transkriptionspolymeras kedjereaktion (qRT-PCR) i råttor peritonealt membran i realtid. Detta protokoll består av fyra steg: 1) rening av peritonealt membranprov; 2) rening av totalt RNA inklusive miRNA från peritonealt membranprov; 3) omvänt transkription av miRNA för att producera cDNA; Och 4) qRT-PCR för att detektera miRNA-uttryck. Med hjälp av detta protokoll bestämde vi framgångsrikt att uttrycket av sex miRNA (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 och miRNA-34a-5p) ökadeSignifikant i peritonealmembranet hos en peritoneal fibrosmodell i råtta jämfört med de i kontrollgrupper. Detta protokoll kan användas för att studera profilen av miRNA-uttryck i peritonealt membran hos råttor under många patologiska förhållanden.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) är korta, icke-kodande RNA som post-transkriptionellt reglerar uttrycket RNA (mRNA) uttryck 1 . Förändringar i uttrycket av miRNA reglerar uttrycket av många mRNA som spelar pivotala roller i olika patologiska tillstånd, inklusive cancer, inflammation, metaboliska störningar och fibros 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Därför har miRNAs potential som nya biomarkörer och terapeutiska mål 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . MiRNA-expressionsprofilen har bestämts i olika råttorOrgan och vävnader, inklusive lever, hjärta, lung och njure 9 . Standardmetoder för rening och detektion av miRNA i råttor-peritonealmembran har emellertid inte varit väl etablerade.
Det övergripande målet med detta protokoll är att framgångsrikt rena och detektera miRNA i råtta-peritonealt membran. Först homogeniserades peritonealmembranprovet med användning av en glashomogenisator följt av exponering för ett biopolymer-fragmenteringssystem i en mikrocentrifugspinnkolonn 10 . Därefter renades totalt RNA inklusive miRNA från peritonealt membranprov med användning av en silikamembranbaserad spinnkolonn 10 . Sedan syntetiserades cDNA från det renade totala RNA med användning av omvänt transkriptas, poly (A) -polymeras och oligo-dT-primer 11 . Slutligen bestämdes uttrycket av miRNA genom qRT-PCR med användning av ett interkalerande färgämne 11 . Skälen till detta protokoll är bAsed vid tidigare studier som visade signifikant rening och detektion av miRNA i vävnader genom en enkel process 8 , 10 , 11 . Det har rapporterats att användningen av ett biopolymer-fragmenteringssystem i en mikrocentrifugspinnkolonn och silikamembranbaserad spinnkolonn kan rena högkvalitativt totalt RNA från vävnaderna 10 . Metoden att syntetisera cDNA från renat totalt RNA med användning av omvänt transkriptas, poly (A) -polymeras och oligo-dT-primer och metoden för att detektera miRNA-uttryck med qRT-PCR med användning av interkalerande färgämne i detta protokoll har rapporterats visa hög noggrannhet och Känslighet 11 . Dessutom är det en enkel process, vilket sparar tid och förhindrar tekniska fel. Därför är detta protokoll användbart i studier som kräver mycket noggrann och känslig detektering av miRNA i råtta peritonealt membran i ett brett spektrum av patologiska tillstånd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Användning av protokollet som presenteras i detta manuskript renades miRNA i råttor-peritonealt membran med framgång och användes med användning av qRT-PCR. Tillförlitligheten av qRT-PCR-dataanalys beror på kvaliteten på renade miRNA. Därför kan renheten hos miRNA kontrolleras före qRT-PCR genom förhållandet absorbans vid 260 nm till det vid 280 nm, vilket kan mätas med användning av en spektrofotometer. När signifikant amplifiering av miRNA inte kan erhållas med användning av qRT-PCR, kan koncentratio…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Miyako Shigeta för sitt utmärkta tekniska stöd. Detta arbete stöddes delvis av JSPS KAKENHI (bidragsnummer 25461252).
Materials
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
| miRNA-142-3p primer | Qiagen | MS00031451 | 5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3' |
| miRNA-21-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3' |
| miRNA-221-3p primer | Qiagen | MS00003857 | 5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3' |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00033320 | 5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3' |
| miRNA-34a-5p primer | Qiagen | MS00003318 | 5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3' |
| miRNA-327 primer | Qiagen | MS00000805 | 5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3' |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| methylglyoxal | Sigma-Aldrich | M0252 | |
| Midperic | Terumo | not assign | peritoneal dialysis fluid |
| Sprague–Dawley rats | SLC | not assign |
Referências
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).
- Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).
- Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).
- Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
- Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem Biophys Res Commun. , (2015).
- Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
- Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. J Surg Oncol. , (2015).
- Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Transl Res. 169, 47-66 (2016).
- Minami, K., et al. miRNA expression atlas in male rat. Sci Data. 1, 140005 (2014).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. Pathophysiology of peritoneal membrane failure. Perit Dial Int. 20, S22-S42 (2000).
- Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N. The pathophysiology of the peritoneal membrane. J Am Soc Nephrol. 21 (7), 1077-1085 (2010).
- Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).
- Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR — how well do they correlate?. BMC Genomics. 6, 59 (2005).
- Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data–is it really necessary?. Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).
