In Vitro und In Vivo Beurteilung der T, B und myeloische Zellen Suppressive Aktivität und humorale Reaktionen von Transplantationspatienten
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zum induzieren Toleranz in der Transplantationsmedizin und in Vitro und in Vivo zu bewerten, die unterdrückende unterschiedliche Zelle Teilmengen des Empfängers und der Immunstatus des Empfängers in Richtung Spender oder exogene Antigene.
Abstract
Das Hauptanliegen der Transplantation ist, spezifische Toleranz durch Induktion von regulatorischen Zellen zu erreichen. Das Verständnis der Mechanismen der Toleranz erfordert zuverlässige Modelle. Hier beschreiben wir Modelle der Toleranz gegenüber cardiac Allograft in Ratte, induziert durch Blockade der Costimulation Signale oder durch Hochregulation von immunregulatorische Molekülen durch Gentransfer. Jedes dieser Modelle erlaubt in Vivo Generierung von regulatorischen Zellen wie regulatorische T-Zellen (Tregs), regulatorische B-Zellen (Bregs) oder regulatorische myeloische Zellen (RegMCs). In diesem Manuskript beschreiben wir zwei zusätzliche Protokolle, die verwendet wurden, um zu identifizieren und definieren in Vitro und in Vivo -regulatorischen Zell-Aktivität zu bestimmen, ihre Verantwortung in der Toleranzinduktion und Wartung. Erstens ein in-vitro- suppressive Assay erlaubt schnelle Identifizierung von Zellen mit suppressive Kapazität auf Effektor Immunantworten in einer Dosis-abhängigen Weise und kann für weitere Analysen wie Cytokine Messung oder Zytotoxizität verwendet werden. Zweitens markiert die Adoptiveltern Übertragung von Zellen von einem toleranten behandelten Empfänger an einen neu bestrahlten veredelte Empfänger der tolerogene Eigenschaften dieser Zellen im Transplantat gerichtet Immunantworten zu kontrollieren bzw. Umwandlung von neuen regulatorischen Zellen ( infektiöse Toleranz bezeichnet). Diese Methoden beschränken sich nicht auf Zellen mit bekannten phänotypische Markierungen und können auf jede Zellenbevölkerung ausgedehnt werden. Darüber hinaus gerichtet Spender Allospecificity der regulatorischen Zellen (ein wichtiges Ziel im Feld) mithilfe Dritter Spenderzellen beurteilt werden können oder in Vitro oder in Vivo-Transplantat. Schließlich, um die spezifischen tolerogene Kapazität dieser regulatorischen Zellen zu bestimmen, bieten wir Protokolle zur Beurteilung der humoralen Anti-Spender Antikörperantworten und die Fähigkeit des Empfängers, humorale Reaktionen gegen neue oder ehemalige bekannte Antigene entwickeln. Die Modelle der Toleranz beschrieben können verwendet werden, um weitere regulatorische Zellen zur Ermittlung neuer Biomarker und immunregulatorische Moleküle, charakterisieren und sind anpassungsfähig an andere Transplantation Modelle oder Autoimmunerkrankungen in Nagetier oder menschliche.
Introduction
Cardiac Allograft in Ratte ist ein zuverlässiger Organ Transplantation Modell zur Bewertung der Toleranz-Induktion-Behandlungen, um die Mechanismen der Toleranzinduktion und Wartung, zu entschlüsseln und hat das Potenzial, funktionell zuständigen und dominante regulatorische Zellen induzieren. Die folgenden Protokolle beschreiben eine voll Missverhältnis heterotopisch kardiale Transplantat von Lewis 1W Spender Ratte (LEW.1W, RT1u) in eine Lewis 1A Empfänger Ratte (LEW.1A, RT1ein). In dieser Kombination Transplantat akuten Abstoßung tritt schnell (in ca. 7 Tage) und von Graft schlagen Messung durch Abtasten des Bauches leicht beurteilt werden kann. Hier schlagen wir drei Protokolle, um die Toleranz gegenüber der cardiac Allograft in Ratte zu induzieren. In diesen Modellen ist Toleranz induzierte bzw. von verschiedenen regulatorischen Zelltypen gepflegt. Erstens die Blockierung des CD40-CD40L Interaktionen mit einer Codierung CD40Ig Adenovirus (AdCD40Ig) induziert die Generation der CD8+ Tregs fähig induzierende Toleranz bei adoptively auf sekundäre veredelte Empfänger1übertragen. Darüber hinaus Erschöpfung der CD8+ Zellen (mit Anti-CD8α Antikörper) in AdCD40Ig behandelt Empfänger erzeugt Bregs und RegMCs2. Tiefenanalyse der CD8+ Tregs Eigenschaften die Schlüsselrolle der mehrere immunregulatorische Moleküle definiert als Interleukin-34 (IL-34) und Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 hervorgehoben . Während Überexpression des IL-34 (mit AAV-Vektor) Tregs durch Generierung von RegMCs induziert, induzierte Überexpression des FGL-2 Bregs, das komplexe Netzwerk von regulatorischen Zellen zugrunde.
Da chronische Ablehnung entwickelt sich langsam und langfristig ist, ist eine eingehende Analyse erforderlich, um Toleranz gegen chronische Ablehnung zu unterscheiden. Transplantat bemisst sich in der Regel für Zelle Infiltration, Fibrose, Verdickung der vaskulären Wand und Ergänzung C4d-Abscheidung von Immunhistologie7. Während Histologie Methoden Tieropfer erfordern oder Biopsie-Transplantat, hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Bestimmung der unterschiedlichen Merkmale der tolerierten Allograft: die Entstehung und Funktion der regulatorischen Zellen und die spezifischen Antikörper Anti-Spender-Antworten aus Blut Probe durch Durchflusszytometrie (Wir verwendeten hier, Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS)).
Wartung der Toleranz gegenüber der Allograft nach Verhaftung der Behandlung ist in der Regel verbunden mit der Induktion von regulatorischen Zellen8. In den letzten Jahrzehnten Studien konzentrierten sich auf CD4+Tregs einstimmig charakterisiert sie durch die wichtigsten Marker Foxp3+, CD25hochund CD127–9,10,11. In ähnlicher Weise mehrere Markierungen wurden CD8 zugeschrieben+ Tregs, wie CD122+, CD28–, CD45RCniedrig, PD1+, und Helios+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. im Laufe der Jahre Ausdruck von GITR, CTLA4 und Zytokine (IL-10, IL-35, TGFβ, IL-34 FGL-2) wurden zusätzlich mit einem Treg Profil3,4,6,13, verbunden 18,19,20,21. Aufstrebenden regulatorischen Zell-Populationen, z. B. Bregs, RegMCs oder NKTregs, fehlen aber entsprechende spezifische Marker. In der Tat, Bregs sind meist als Unreife CD24 berichtet+ Zellen mit zweideutigen CD27 Ausdruck und manchmal Produktion von IL-10 und TGFβ Granzym B22,23,24. Die Komplexität der myeloischen Zellen Linie erfordert eine Kombination von mehreren Marker definieren ihre behördlichen oder proinflammatorischen Profil z. B. CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a oder CD16325,26. Zu guter Letzt einige Marker gemeldet wurden, um NKTregs wie CD11b zu identifizieren+, CD27+, TGFβ+, aber weitere Studien sind erforderlich, um weitere phänotypisch27,28,29 beschreiben ,30,31,32. So Beweise suppressive Aktivität sind erforderlich, um weiteren phänotypischen Beschreibung für die Identifizierung neuer Biomarker, legitimieren neue immunregulatorische Vermittler und Ausweitung des Anwendungsbereichs auf neue Zelltherapien.
Wir schlagen zwei komplementäre Methoden um die suppressive Aktivität der Zellen zu bewerten. Erstens die in-vitro- Methode besteht darin, unterdrückende Zellen mit beschrifteten T-Effektorzellen angeregt durch allogene Spender antigenpräsentierende Zellen (APCs) bei unterschiedlichen Verhältnissen in 6 Tagen Kultivierung und Analyse der Effektor T Zell-Proliferation, unter der Regie von Spender Immunsuppression widerspiegelt. Zellen von behandelten Ratten können direkt mit Zellen von naiven Ratten und unbehandelten veredelte Ratten für suppressive Aktivität (oder andere regulatorische Zell-Population), in einer Reihe von Suppressor: Effektor Verhältnisse verglichen werden. Darüber hinaus diese Methode erfordert kein Transplantation, und Ergebnisse sind innerhalb von 6 Tagen. Zweitens besteht die in-Vivo -Methode die beabsichtigten regulatorischen Zellen von einer behandelten Ratte an einen neu bestrahlten veredelte Empfänger übertragen. Während B-Zellen, myeloische Zellen oder T-Zellen aus unbehandelten naiv Ratten sind in der Regel nicht in der Lage, akuten Abstoßung zu hemmen und Transplantat-Überleben bei Adoptiveltern Übertragung zu verlängern, Zellen mit potenzierten suppressive Aktivität von behandelt-Empfänger haben diese Attribute 1,2,3,4,33. Lymphopenie induziert durch Bestrahlung des Empfängers wird empfohlen, adoptively übertragene Zellen, Blut Homöostase unberührt und die Anti-Spender-Immunantworten leichter meistern können. Für beide Methoden, die in-vitro- Nutzung der allogenen APCs oder in Vivo Adoptiv Übertragung von suppressive Dritter ermöglichen Zellen zu Empfängern veredelt mit einem Drittanbieter-Herzen Analyse der Spezifität Anti-Spender. Die in-Vivo -Methode erfordert eine beträchtliche Anzahl von Zellen, schlecht vertreten können Zelle Subpopulationen leichter suppressive Aktivität in Vitro33bewertet werden.
Humorale Reaktionen können auch gemessen werden, um den Zustand der Toleranz und der Kontrolle der gerichtete Antikörperreaktionen auf Spender Antigene zu beurteilen. In der Tat kann Toleranz keine humorale Antwort in Richtung der Spender aber Erhaltung der Kapazität für die Empfänger, humorale Antwort auf neue Antigene entwickeln und Bewahrung der Erinnerung Reaktionen charakterisiert werden. Erstens basiert das Prinzip der Alloantibody-Erkennung auf Anerkennung der Spenderzellen durch Empfänger Antikörper nach Inkubation der Spender Zelltyp mit Serum von einem veredelten Empfänger. Zweite, humorale Reaktionen auf exogene Antigene gerichtet können bewertet folgende Stimulation der langfristigen tolerant Empfänger mit Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) mit kompletten Freund der adjuvanten emulgiert werden. Das Vorhandensein von IgM und IgG Antikörper gegen Antigene kann 4 und 13 Tage, bzw. nach Immunisierung mit Enzym verknüpften Immunosorbentprobe Assay (ELISA)34nachgewiesen werden. Drittens kann die Erhaltung des Immunsystems Speicher Antworten am Tage-7 und + 3 Transplantation und Erythrozyten Färbung mit Empfänger Serum am Tage gesammelt + 8 und + 17 nach Transplantation durch Injektion von xenogene roten Blutkörperchen (Erythrozyten) beurteilt werden. Alle diese Methoden erlauben die Identifizierung von Immunglobulin-Subtypen mit spezifischen Sekundärantikörper und schnelle Erfassung der Ergebnisse in weniger als 1,5 h von FACS Färbung oder ein paar Stunden von ELISA.
Schließlich diese Protokolle sind für die Charakterisierung der Transplantation Modelle konzipiert und können in gewisser Hinsicht auf Autoimmunerkrankung Modelle angewendet. Die Prinzipien der Methode können auf alle Arten umgesetzt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adoptiveltern Übertragung des gesamten Splenocyten in einen neu verpflanzten Empfänger ist eine effiziente Möglichkeit, das Vorhandensein von regulatorischen Zellen induziert oder durch eine Behandlung potenzierte erkennen. Host Bestrahlung-induzierte vorübergehende Lymphopenie fördert Zelle Überleben nach der Übertragung und Etablierung der Toleranz. Darüber hinaus lässt subletale Bestrahlung Zeit für Zellen mit tolerogene Eigenschaften zum neuen regulatorischen Zellen während Immunrekonstitution, ein Phänom…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde realisiert im Rahmen des Projekts Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01) ist Teil des Programms “Investissements Avenir” französische Regierung verwaltet durch die ANR (ANR-11-LABX-0016-01) und die IHU-Cesti Projekt auch durch die ” Investissements Avenir”französische Regierung Programm, verwaltet von der französischen nationalen Forschung Agentur (ANR) (ANR-10-IBHU-005). IHU-Cesti-Projekt wird auch von Nantes Métropole und Région Pays De La Loire unterstützt.
Materials
| animals | |||
| LEW.1W and LEW.1A rats | Janvier Labs, France | 8 weeks old, | |
| BN third party donor rats | Janvier Labs, France | 8 weeks old, | |
| nome | company | catalogue number | comments |
| reagents | |||
| AdCD40Ig | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
| IL34-AAV | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
| FGL2-AAV | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
| anti-TCR | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | R7/3 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD25 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX39 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD8 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX8 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD45RA | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX33 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD161 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | 3.2.3 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD11b/c | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX42 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-TCRgd | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | V65 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD45RC | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX22 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD4 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX35 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD45R | BD Biosciences, Mountain View, CA | #554881, His24 clone | |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA | #112-096-071 | |
| anti-rat IgG1 | Serotec | #MCA 194 | |
| anti-rat IgG2a | Serotec | #MCA 278 | |
| anti-rat IgG2b | Serotec | #MCA 195 | |
| anti-rat IgM-FITC | Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA | #115-095-164 | |
| streptavidin HRP | BD Biosciences, Mountain View, CA | #554066 | |
| KLH | Sigma Aldrich, St. Louis, USA | #9013-72-3 | |
| PBS 1X | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, | |
| Tween 20 | Sigma, Saint-Louis, USA | #9005-64-5 | |
| TMB substrate reagent kit | BD Biosciences, Mountain View, CA | #555214 | |
| CellTraceTM CFSE cell proliferation kit | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #C34554 | |
| RPMI 1640 medium 1X | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #31870-025 | |
| penicilline streptomycine | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #15140-122 | |
| Hepes Buffer | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #15630-056 | |
| non essential amino acids | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #11140-035 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #11360-039 | |
| 2 beta mercaptoethanol | Sigma, Saint-Louis, USA | #M3148 | |
| Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #65-0842-85 | |
| Glutamine | Sigma, Saint-Louis, USA | #G3126 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #D1306 | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics, Germany | #11088882001 | |
| EDTA | Sigma, Saint-Louis, USA | #E5134 | |
| NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | #B230561 | |
| Magnetic dynabeads | Dynal, Invitrogen | #11033 | Goat anti-mouse IgG |
| One Comp eBeads | Ebiosciences, San Diego, USA | #01-1111-42 | |
| Betadine | Refer to the institutional guidelines | ||
| Isoflurane | Refer to the institutional guidelines | ||
| Naplbuphine | Refer to the institutional guidelines | ||
| Terramycine | Refer to the institutional guidelines | ||
| Buprenorphine | Refer to the institutional guidelines | ||
| Meloxicam | Refer to the institutional guidelines | ||
| Complete Freund's adjuvant | |||
| Rompun | Refer to the institutional guidelines | ||
| Ringer lactate | Refer to the institutional guidelines | ||
| Ketamine | Refer to the institutional guidelines | ||
| Red blood cell lysis solution | Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O. | ||
| Collagenase D | Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS | ||
| PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) | Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X | ||
| CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) | Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution | ||
| complete medium for coculture | 500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS | ||
| nome | company | catalog number | comments |
| equipments | |||
| falcon 50ml | BD Biosciences, Mountain View, CA | #227261 | |
| falcon 15ml | BD Biosciences, Mountain View, CA | #188271 | |
| sieve | |||
| Corning plastic culture dishes | VWR, Pessac | #391-0439 | |
| 100µm and 60µm tissue filters | Sefar NITEX, Heiden, Switzerland | #03-100/44 and #03-60/35 | |
| 96 wells U bottom plates for coculture | Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning | #353077 | |
| 96 wells V bottom plates for FACS staining | ThermoScientifique, Danemark | #249570 | |
| 96 wells flat bottom ELISA plates | Nunc Maxisorb | ||
| seringue for spleen crush | BD Biosciences, Mountain View, CA | #309649 | |
| ELISA reader | SPARK 10M, Tecan, Switzerland | SPARK 10M, Tecan, Switzerland | |
| centrifuge | |||
| bain marie | |||
| X rays irradiator | Lincolshire, England | Faxitron CP160 | |
| solar agitator | |||
| FACS Canto II | BD Biosciences, Mountain View, CA | ||
| FACS Aria II | BD Biosciences, Mountain View, CA | ||
| magnet | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | 12302D |
Referências
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