Exposição do SNC porco para análise histológica: A manual por decapitação, crânio de abertura, e Cérebro Remoção
Summary
O objectivo deste trabalho e vídeo de instruções é descrever como a expor e remover o cérebro de porco e glândula pituitária pós-morte num estado intacto, adequado para análise macroscópica e histológica subsequente.
Abstract
Os porcos têm se tornado cada vez mais popular em grande animal investigação translacional neurociência como um substituto economicamente e eticamente viável para primatas não-humanos. O tamanho grande do cérebro do porco permite o uso de geradores de imagens cerebrais clínica convencionais e a utilização directa e testes de procedimentos e equipamentos neurocirúrgicos de clínica humana. Uma análise mais aprofundada macroscópico e histológico, no entanto, requer exposição post-mortem do sistema de porco nervoso central (SNC) e subsequente remoção do cérebro. Esta não é uma tarefa fácil, como o porco SNC é encapsulado por uma cabeça dura, ósseo e da coluna vertebral. O objectivo deste trabalho e vídeo de instruções é descrever como a expor e remover o cérebro de porco post-mortem e a glândula pituitária num estado intacto, adequado para análise macroscópica e histológica subsequente.
Introduction
estudos de neurociência de translação em suínos têm se tornado cada vez mais popular durante as últimas duas décadas. O grande tamanho do cérebro de porco permite o uso de geradores de imagens cerebrais clínica convencionais e a utilização directa e os ensaios de procedimentos neurocirúrgicos e equipamento de clínica humana 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. Nos últimos 20 anos, porcos, especialmente porcos chineses (por exemplo, Gottingen minipig), foram usadas para examinar as modalidades de tratamento neuromoduladores, tais como transplante de células estaminais; transfecção de vector viral; e estimulação cerebral profunda dirigida para a doença de Parkinson, obesidade, depressão, doença de Alzheimer e 2, 6,= "refex"> 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Esta foi seguida pelo desenvolvimento de abordagens cirúrgicas estereotáxicas e para manipular o minipig SNC 3, 18, 19, 20, 21. As alterações do sistema nervoso central instituídos foram avaliadas em animais vivos utilizando imagiologia cerebral (PET 10, 13, 22, 24 e 23 MR), cistometria 11, 12, 25, a análise da marcha17, a avaliação neurológica 9, 17, e exame pós-morte com base na histologia e análise estereologia 14, 15, 17, 26, 27, 31. No entanto, a análise post-mortem requer a exposição e a remoção do cérebro de porco, que não é uma tarefa fácil, como uma cabeça dura, ósseo e uma dura-máter fibrosa que cobre rodeiam o cérebro de porco.
O objectivo deste trabalho e vídeo de instruções é descrever como o cérebro de porco post-mortem e na pituitária podem ser expostos e removido em estado intacto em 15-20 min, utilizando instrumentos cirúrgicos não motorizados. O vídeo de instruções e ilustrações fotográficas mostram miniporcos do sexo masculino (idade: 6 meses, peso corporal: 20-25 kg) utilizados para um estudo anatômico na glândula pituitária minipig.
Protocol
Representative Results
Discussion
A maior parte dos estudos experimentais neuroscience são realizados em espécies animais pequenos, tais como ratinhos e ratos, em que o acesso ao SNC é facilitado por um de espessura da dura-máter e o crânio fina. No entanto, em animais experimentais maiores, como porcos 1, 4, 8, ovinos 32, e primatas não-humanos, a espessura considerável destas estruturas que requer a utilização de instrumentos …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem com gratidão a ajuda hábil de Sra Trine W. Mikkelsen, Sra Lise M. Fitting, e os funcionários da Påskehøjgaard. O Medical Conselho Dinamarquês de Pesquisas, a Fundação Lundbeck, ea Nordisk Fundação Novo suportado financeiramente o estudo.
Materials
| Heavy Scalpel Handle #4 | FST (Fine Science Tools) | 10008-13 | Good for skin incision and soft tissue removal |
| Non-Sterile Scalpel Blades #23 | FST | 10023-00 | |
| Scalpel Handle #7 | FST | 10007-12 | Optimal for dural incision and precision work |
| Non-Sterile Scalpel Blades #11 | FST | 10011-00 | |
| Surgical Forceps | FST | 11024-18 | The tip of the surgical forceps ensure a firm grip |
| Kerrison Bone Punch | Aesculap Neurosurgery | FF713R | Must be robust, bite size 3-5 mm |
| Bone Rongeur | Aesculap Neurosurgery | MD615 | Must be robust, bite size 15 x 5 mm |
| Bone Rongeur | Aesculap Neurosurgery | FO551R | Must be robust, bite size 25 x 15 mm |
| Bone Chisel | Lawton | 67-0335 | The size of the chisel head should not exceed 20 mm |
| Mallet (Hammer) | Millarco | 5624108 | Weigth 300 g, length 30 cm, head hit area size 2 x 2 cm |
| Micro-Scissor | FST | 14002-14 | |
| Dissector | Aesculap Neurosurgery | OL165R | |
| Göttingen minipigs | Ellegaard Göttingen Minipigs A/S, Denmark | ||
| Euthanimal | pentobarbital | ||
| Ketamine | Pfizer | ||
| Midazolam | Hameln Pharmaceuticals |
Referências
- Lind, M. N., Moustgaard, A., Jelsing, J., Vajta, G., Cumming, P., Hansen, A. K. The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders. Neurosci Biobehav Rev. 31, 728-751 (2007).
- Bjarkam, C. R., et al. Neuromodulation in a minipig model of Parkinson disease. British J Neurosurg. 22 (Suppl. 1), S9-S12 (2008).
- Bjarkam, C. R., Cancian, G., Glud, A. N., Ettrup, K. S., Østergaard, L., Sørensen, J. C. MRI-guided stereotaxic targeting in pigs based on a stereotaxic localizer box fitted with an isocentric frame and use of SurgiPlan computer-planning software. J Neurosci Methods. 183 (2), 119-126 (2009).
- Sauleau, P., Lapouble, E., Val-Laillet, D., Malbert, C. H. The pig model in brain imaging and neurosurgery. Animal. 3 (8), 1138-1151 (2009).
- Bjarkam, C. R., et al. Safety and function of a new clinical intracerebral microinjection instrument for stem cells and therapeutics examined in the Göttingen minipig. Stereotact Funct Neurosurg. 88 (1), 56-63 (2010).
- Fjord-Larsen, L., et al. Long-term delivery of nerve growth factor by encapsulated cell biodelivery in the minipig basal forebrain. Mol Therapy. 18 (12), 2164-2172 (2010).
- Sørensen, J. C., et al. Development of neuromodulation treatments in a large animal model – Do neurosurgeons dream of electric pigs?. Prog Brain Res. 194, 97-103 (2011).
- Dolezalova, D., et al. Pig models of neurodegenerative disorders: utilization in cell replacement-based preclinical safety and efficacy studies. J Comp Neurol. 522 (12), 2784-2801 (2014).
- Mikkelsen, M., Moller, A., Jensen, L. H., Pedersen, A., Harajehi, J. B., Pakkenberg, H. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
- Danielsen, E. H., et al. The DaNEX study of embryonic mesencephalic, dopaminergic tissue grafted to a minipig model of Parkinson’s disease: Preliminary findings of effect of MPTP poisoning on striatal dopaminergic markers. Cell Transplant. 9 (2), 247-259 (2000).
- Dalmose, A., Bjarkam, C. R., Sørensen, J. C., Jørgensen, T. M., Djurhuus, J. C. Effects of high frequency deep brain stimulation on urine storage and voiding function in conscious minipigs. Neurourol Urodyn. 23 (3), 265-272 (2004).
- Dalmose, A., Bjarkam, C. R., Djurhuus, J. C. Stereotactic electrical stimulation of the pontine micturition center in the pig. Br J Urol. 95, 886-889 (2005).
- Andersen, F., Watanabe, H., Bjarkam, C. R., Danielsen, E. H., Cumming, P. Pig brain stereotaxic standard space: Mapping of cerebral blood flow normative values and effect of MPTP-lesioning. Brain Res Bull. 66 (1), 17-29 (2005).
- Glud, A. N., et al. Direct gene transfer in the minipig CNS using stereotaxic lentiviral microinjections. Acta Neurobiol Exp. 70 (3), 1-8 (2010).
- Glud, A. N., et al. Direct MRI-guided stereotaxic viral mediated gene transfer of alpha-synuclein in the minipig CNS. Acta Neurobiol Exp. 71 (4), 508-518 (2011).
- Ettrup, K. S., Sørensen, J. C., Rodell, A., Alstrup, A. K. O., Bjarkam, C. R. Hypothalamic deep brain stimulation influences autonomic and limbic circuitry involved in the regulation of aggression and cardiocerebrovascular control in the minipig. Stereotact Funct Neurosurg. 90 (5), 281-291 (2012).
- Nielsen, M. S., et al. Continuous MPTP intoxication in the minipig results in chronic parkinsonian deficits. Acta Neurobiol Exp. 76, 198-210 (2016).
- Bjarkam, C. R., et al. A MRI-compatible stereotaxic localizer box enables high-precision stereotaxic procedures in pigs. J Neurosci Methods. 139 (2), 293-298 (2004).
- Bjarkam, C. R., Jorgensen, R. L., Jensen, K. N., Sunde, N. A. A., Sørensen, J. C. H. Deep brain stimulation electrode anchoring using BioGlue®, a protective electrode covering, and a titanium microplate. J Neurosci Methods. 168, 151-155 (2008).
- Ettrup, K. S., et al. Basic Surgical Techniques in the Minipig: Intubation, Transurethral Bladder Catheterization, Femoral Vessel Catheterization, and Transcardial Perfusion. J Vis Exp. (52), e2652 (2011).
- Ettrup, K. S., Tornøe, J., Sørensen, J. C., Bjarkam, C. R. A surgical device for minimally invasive implantation of experimental deep brain stimulation leads in large research animals. J Neurosci Methods. 200 (1), 41-46 (2011).
- Danielsen, E. H., et al. Positron emission tomography of living brain in minipigs and domestic pigs. Scand J Lab Anim Sci Suppl. 25 (1), 127-135 (1998).
- Røhl, L., et al. Time evolution of cerebral perfusion and ADC measured by MRI in a porcine stroke model. J Magn Reson Imaging. 15 (2), 123-129 (2002).
- Cumming, P., Gillings, N. M., Jensen, S. B., Bjarkam, C. R., Gjedde, A. Kinetics of the uptake and distribution of the dopamine D2/3 agonist (R)-N-[1-11C]n-propylnorapomorphine in brain of healthy and MPTP-poisoned Gottingen miniature pigs. Nucl Med Biol. 30 (5), 547-553 (2003).
- Jensen, K. N., Deding, D., Sørensen, J. C., Bjarkam, C. R. Long-term implantation of deep brain stimulation electrodes in the pontine micturition centre of the minipig. Acta Neurochir. 151 (7), 785-794 (2009).
- Rosendal, F., et al. Does chronic low dose treatment with ciclosporin influence the brain? A histopathological study in pigs. Transplantation Proc. 37 (8), 3305-3308 (2005).
- Nielsen, M. S., Sørensen, J. C., Bjarkam, C. R. The substantia nigra pars compacta of the minipig: An anatomical and stereological study. Brain Struct Funct. (4-5), 481-488 (2009).
- Sørensen, J. C., Bjarkam, C. R., Simonsen, C. Z., Danielsen, E., Geneser, F. A. Oriented sectioning of irregular tissue blocks in relation to computerized scanning modalities. Results from the domestic pig brain. J Neurosci Methods. 104, 93-98 (2000).
- Bjarkam, C. R., Pedersen, M., Sørensen, J. C. New strategies for embedding, orientation and sectioning of small brain specimens enable direct correlation to MR-images, brain atlases, or use of unbiased stereology. J Neurosci Methods. 108, 153-159 (2001).
- Bjarkam, C. R., Sørensen, J. C., Geneser, F. A. Distribution and morphology of serotonin-immunoreactive axons in the hippocampal region of the New Zealand white rabbit. I. Area dentata and hippocampus proper. Hippocampus. 13 (1), 21-37 (2003).
- Bjarkam, C. R., Glud, A. N., Orlowski, D., Sørensen, J. C., Palomero-Gallagher, N. The telencephalon of the minipig, cytoarchitecture and cortical surface anatomy. Brain Struct Funct. , (2016).
- Boltze, J., Nitzsche, B., Geiger, K. D., Schoon, H. A. Histopathological investigation of different MCAO modalities and impact of autologous bone marrow mononuclear cell administration in an ovine stroke model. Transl Stroke Res. 2, 279-293 (2011).
- Jortner, B. S. The return of the dark neuron. A histological artifact complicating contemporary neurotoxicologic evaluation. Neurotoxicology. 27, 628-634 (2006).
