This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.
Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.
В тканевой инженерии и биодатчиков, способность контролировать пространственную организацию белков и клеток по шкале мкм, приобретает все большее значение в течение последних четырех десятилетий 1, 2, 3. Точная пространственная организация белков и клеток позволило исследователям изучить взаимодействие между клетками и субстратов , содержащих аналогичные или различные типы клеток, чтобы направлять рост клеток, а также для иммобилизации биомолекул для изготовления биосенсоров 4, 5, 6, 7, 8, 9.
Современные методы формирования паттерна белков включают photopatterning и микроконтактной печати. Photopatterning использует светочувствительный материал, который сшивается при воздействии Ultrфиолетовый (УФ) излучения. УФ – свет направлен на фотошаблон (состоящей из прозрачных областей с темными областями для предотвращения передачи УФ – света) вызывает сшиванием в определенных областях , которые затем могут быть использованы для последующего прикрепления биоматериалов или клеток 10, 11. В то время как эта схема является очень точным и позволяет точно контролировать топографии поверхности культуры, она ограничена УФ-чувствительных биомолекул , которые могут быть составлены по образцу с помощью УФ – излучения 12. Микроконтактной печати является еще одним популярным методом структурирование специфических белков 13, 14. В этом способе, поли-диметил силоксан (PDMS) марка обрабатывают различными модификации поверхности реагентов до того, замачивают в растворе выбранного биомолекул субстрата. Затем аккуратно прижимают покровным стеклом или другой поверхности, таким образом, "штампования" биомолекулу на поверхность культуры. эйВеверу, штамповку ограничивается типом материала , который может быть передан, а также смачиваемость биомолекул на поверхности ПДМС штамп 15.
Прямое структурирование клеток может быть более сложным и опирается на сложные методы , такие как переключаемые подложек, трафаретов на основе методов или кучность с определенными молекулами клеточной адгезии , 16, 17. Эти методы ограничены в их способности шаблон клеток из-за отсутствия совместимых субстратов клеточной адгезии, Несовместимость процессе работы с чувствительными биологическими клетками и ограничениями, несогласованности в воспроизведении формирования рисунка и сложности процедуры. Например, с переключаемыми субстраты, изготовленные на заказ субстраты , должны быть разработаны для каждого типа клеток, чтобы переключить их присоединение к конкретным типам клеток без деградации под воздействием УФ – света и тепла , используемых в процессе 17 < вир класс = "Xref"> 18, 19, 20. Методы, основанные паттерна Трафарет являются универсальными в их способности к модели клеток; Тем не менее, трудно изготовить PDMS трафареты при соответствующих толщинах для использования 16, 21. Прямая инъекция клеток в PDMS микроканалов имеют ряд преимуществ, таких как: 1) легкость в изготовлении микроканалов и 2) пригодность для многих различных клеток и субстратов. Тем не менее, распространенной проблемой захвата пузырьков воздуха в процессе инъекции из – за гидрофобности PDMS без использования плазменной очистки, или другие методы , чтобы уменьшить пузырьков воздуха, затрудняет последовательно создавать узорчатые клетки на стеклянных или пластмассовых поверхностей 21.
Эта работа расширяет капиллярного micromolding 22, 23,деваха = "Xref"> 24, 25, 26 и передает метод впрыснуть белка и клеточные суспензии в микроканалов. Метод, используемый здесь, демонстрирует кучность субстратов и как прямую, так и косвенную структурирование специфических типов клеток. Этот метод позволяет преодолеть высокую гидрофобность PDMS и исключает наличие пузырьков во время инъекции либо субстраты или клетки, воспользовавшись газопроницаемости ПДМС 27. В этом документе показано использование метода с несколькими различными субстратами и типов клеток. В статье также подчеркивается , изготовление пресс – форм для мягкой литографии с использованием обычного фотолитографии, а также простой и клейкую недорогой метод ленты полезный в условиях ограниченных ресурсов 28, 29.
В то время как обычные фотолитографии является хорошо отработанной технологией для создания пресс-форм для мягкой литографии, оборудования, материалов и навыков, необходимых для использования обычного фотолитографии не легко доступны для большинства лабораторий. Для лабораторий, не…
The authors have nothing to disclose.
Финансирование этого исследования было предоставлено Джерси комиссии по Нью-спинного мозга исследований (NJCSCR) (до FHK), грант CSCR14IRG005 (до BLF), NIH грант R15NS087501 (к УПС) и FM Кирби Foundation (ЭТА).
CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools | Corel Corporation, Canada | X4 Version 14.0.0.701 | CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device |
Laser Printer HP | Hewlett Packard, CA | 1739629 | Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique |
Bel-Art Dessicator | Fisher Scientific, MA | 08-594-16B | Used to degass the PDMS mixture |
Adhesive Scotch Tape | 3M Product, MN | Tape 600 | Used to fabricate adhesive tape Master |
PDMS Sylgard 184 | Dow Corning, MI | 1064291 | Casting polymer |
Petri Dish | Fisher Scientific, MA | 08-772-23 | Used to keep the mold to cast with PDMS |
Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11) | Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan | 2976#11 | Used to cut the PDMS |
Tweezers | Ted Pella, CA | 5627-07 | Used to handle the PDMS cast during peeling |
Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-546-2 | Used as surface to pattern the Substrate |
Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-544-4 | Used as surface to pattern the Substrate |
Rubber Roller | Dick Blick Art Materials, IL | 40104-1004 | Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles |
Laser Mask Writer | Heidelberg Instruments, Germany | DWL66fs | Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process |
EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool) | EV Group, Germany | EVG 620T(B) | Used to expose the photoresist to UV light |
Spin Coater Headway | Headway Research Inc, TX | PWM32-PS-CB15PL | Used to spin coat the photoresist on silicon wafer |
Photoresists SU-8 50 | MicroChem, MA | Y131269 | Negative photoresist used for mold fabrication |
SU-8 Devloper | MicroChem, MA | Y020100 | Photoresist developer |
Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane | UCT Specialties, PA | T2492-KG | Coat mold to avoid PDMS adhesion |
Isopropanol | Sigma-Aldrich, MO | 190764 | Cleaning Solvent |
Ethanol | Sigma-Aldrich, MO | 24102 | Sterilization Solvent |
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich, MO | P0899-10MG | PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer |
Laminin | Sigma-Aldrich, MO | L2020 | Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use |
BSA | Fisher Scientific, MA | BP1605100 | Cell culture |
C2C12 Myoblast cell lline | ATCC, VA | CRL-1722 | Used to demonstrate C2C12 patterning |
PC12 Cell Line | ATCC, VA | CRL-1721 | Used to demonstrate PC12 patterning |
Collagen type 1, rat tail | BD Biosciences | 40236 | Cell culture |
DMEM | GIBCO, MA | 11965-084 | Cell culture |
Horse Serum, heat inactivated | Fisher Scientific, MA | 26050-070 | Cell culture |
Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC) | Sigma-Aldrich, MO | P1951 | To label cells |
Calcein-AM live dead cell Assay kit | Invitrogen, MA | L-3224 | Cell viability Assay |
Biopsy Hole Punch | Ted Pella, CA | 15110-10 | Punched hole in PDMS |