Et alsidigt Metode til mønstring Proteiner og celler

Summary

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Abstract

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

Introduction

I tissue engineering og biosensorer, evnen til at styre den rumlige organisering af proteiner og celler på en um skala, er blevet stadig vigtigere i de sidste fire årtier ^{1, 2, 3.} Præcise rumlige organisation af proteiner og celler har tilladt forskere til at undersøge interaktionen mellem celler og substrater, der indeholder tilsvarende eller forskellige typer af celler, til at vejlede cellevækst, og at immobilisere biomolekyler til fremstilling af biosensorer ^{4, 5, 6, 7, 8, 9.}

Aktuelle metoder til mønsterdannende proteiner omfatter photopatterning og microcontact udskrivning. Photopatterning udnytter lysfølsomt materiale, som er tværbundet ved udsættelse for Ultren violet (UV) lys. UV-lys rettet mod en fotomaske (bestående af gennemsigtige områder med mørkere områder for at forhindre UV-lys transmission) forårsager tværbinding i bestemte regioner, som derefter kan anvendes til efterfølgende binding af biomaterialer eller celler ^{10, 11.} Mens denne ordning er meget præcis og giver mulighed for præcis styring af topografien af kulturen overflade, det er begrænset til UV-følsomme biomolekyler, som kan mønstrede ved UV-stråling ^12. Microcontact udskrivning er en anden populær metode til mønstring specifikke proteiner ^{13, 14.} Ved denne metode er en poly-dimethylsiloxan (PDMS) stempel behandlet med forskellige overflademodifikation reagenser inden de lægges i blød i en opløsning af den valgte biomolekylær substrat. Det er derefter forsigtigt presses på et dækglas eller en anden overflade således "stempling" biomolekylet på kultur overflade. However, er stempling begrænset til den type materiale, der kan overføres, samt befugteligheden af biomolekyler til overfladen af PDMS stempel ^15.

Direkte mønsterdannelse af celler kan være vanskeligere og er afhængig af komplekse metoder såsom omskiftelige substrater, stencil baserede metoder eller mønsterdannelse med specifikke celleadhæsionsmolekyler ^{16, 17.} Disse fremgangsmåder er begrænset i deres evne til at mønster celler på grund af manglen på kompatible celleadhæsion substrater, inkompatibilitet af processen arbejder med følsomme biologiske celler og begrænsninger, inkonsistens i reproduktion af mønsterdannelse, og kompleksiteten af ​​proceduren. For eksempel med omskiftelige substrater, behøver tilpassede substrater at være designet til hver celletype, at skifte deres tilslutning til specifikke celletyper uden nedbrydning ved udsættelse for UV lys og varme, der anvendes i processen ^17, < sup class = "xref"> ^{18, 19, 20.} Stencil baserede mønsterdannende metoder er alsidige i deres evne til mønster celler; Det er imidlertid vanskeligt at fremstille PDMS stencils på passende tykkelser til anvendelse ^{16, 21.} Direkte injektion af celler i PDMS mikrofluidkanaler har nogle fordele, såsom: 1) lette i fremstilling af mikrofluide kanaler og 2) egnethed til mange forskellige celler og substrater. Men den udbredte udstedelse af luftboble indfangning under injektionsprocessen grund hydrofobicitet PDMS uden anvendelse af plasma rengøring, eller andre metoder til at formindske luftbobler, gør det vanskeligt at konsekvent skabe mønstrede celler på glas- eller plastoverflader ^21.

Dette arbejde udvider kapillar micromolding ^{22, 23,}lass = "xref"> ^{24, 25, 26} og rapporterer en metode til at injicere protein- og cellesuspensioner i mikrokanaler. Den anvendte metode her viser mønsterdannelse af substrater og både direkte og indirekte mønsterdannelse af specifikke celletyper. Denne teknik overvinder den høje hydrofobicitet PDMS og eliminerer tilstedeværelsen af bobler under indsprøjtning af enten substrater eller celler ved at drage fordel af gaspermeabilitet PDMS ^27. Dette papir viser anvendelsen af ​​teknikken med flere forskellige substrater og celletyper. Artiklen fremhæver også fremstilling af forme til blød litografi hjælp konventionel fotolitografi samt en enkel og billig tape metoden anvendelig i ressource begrænsede indstillinger ^{28, 29.}

Protocol

BEMÆRK: Se venligst alle relevante materiale sikkerhedsdatablade (MSDS) før brug. Nogle af de kemikalier, der anvendes i denne protokol er giftige og kræftfremkaldende. Brug venligst alle passende sikkerhedsforanstaltninger (stinkskab, handskerummet) og personlige værnemidler (sikkerhedsbriller, handsker, lab coat, fuld længde bukser, lukkede-toe sko), når der anvendes giftige eller syre / base-materialer. 1. Fremstilling af Master forme til Soft Litografi hjælp Fotolitografi <l…

Representative Results

Denne metode gør det muligt at mønstret af proteiner og indirekte mønster af celler ved hjælp af dead-end mikrofluide kanaler med dimensioner så små som 10 um og udstyr til rådighed i næsten alle biologiske laboratorier, når master formen er lavet. Denne teknik kan anvendes med PDMS mikrofluidkanaler skabt ved hjælp af traditionel blød fotolitografi, eller med PDMS mikrofluidkanaler oprettet med tape fabrikation (figur 1) 28,…

Discussion

Mens konventionelle fotolitografi er en veletableret teknik til fremstilling af forme til blød litografi, det udstyr, materialer, og færdigheder er nødvendige for at bruge konventionel fotolitografi er ikke let tilgængelige for de fleste laboratorier. For laboratorier uden adgang til disse ressourcer, har vi præsenteret tape fabrikation som en metode til at skabe forme med relativt simple funktioner til mikrofluidenheder. Denne metode giver alle laboratorier til at skabe og udnytte mikrofluidenheder til forskningsf…

Materials

CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools	Corel Corporation, Canada	X4 Version 14.0.0.701	CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device
Laser Printer HP	Hewlett Packard, CA	1739629	Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique
Bel-Art Dessicator	Fisher Scientific, MA	08-594-16B	Used to degass the PDMS mixture
Adhesive Scotch Tape	3M Product, MN	Tape 600	Used to fabricate adhesive tape Master
PDMS Sylgard 184	Dow Corning, MI	1064291	Casting polymer
Petri Dish	Fisher Scientific, MA	08-772-23	Used to keep the mold to cast with PDMS
Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11)	Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan	2976#11	Used to cut the PDMS
Tweezers	Ted Pella, CA	5627-07	Used to handle the PDMS cast during peeling
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-546-2	Used as surface to pattern the Substrate
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-544-4	Used as surface to pattern the Substrate
Rubber Roller	Dick Blick Art Materials, IL	40104-1004	Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles
Laser Mask Writer	Heidelberg Instruments, Germany	DWL66fs	Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process
EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool)	EV Group, Germany	EVG 620T(B)	Used to expose the photoresist to UV light
Spin Coater Headway	Headway Research Inc, TX	PWM32-PS-CB15PL	Used to spin coat the photoresist on silicon wafer
Photoresists SU-8 50	MicroChem, MA	Y131269	Negative photoresist used for mold fabrication
SU-8 Devloper	MicroChem, MA	Y020100	Photoresist developer
Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane	UCT Specialties, PA	T2492-KG	Coat mold to avoid PDMS adhesion
Isopropanol	Sigma-Aldrich, MO	190764	Cleaning Solvent
Ethanol	Sigma-Aldrich, MO	24102	Sterilization Solvent
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich, MO	P0899-10MG	PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer
Laminin	Sigma-Aldrich, MO	L2020	Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use
BSA	Fisher Scientific, MA	BP1605100	Cell culture
C2C12 Myoblast cell lline	ATCC, VA	CRL-1722	Used to demonstrate C2C12 patterning
PC12 Cell Line	ATCC, VA	CRL-1721	Used to demonstrate PC12 patterning
Collagen type 1, rat tail	BD Biosciences	40236	Cell culture
DMEM	GIBCO, MA	11965-084	Cell culture
Horse Serum, heat inactivated	Fisher Scientific, MA	26050-070	Cell culture
Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC)	Sigma-Aldrich, MO	P1951	To label cells
Calcein-AM live dead cell Assay kit	Invitrogen, MA	L-3224	Cell viability Assay
Biopsy Hole Punch	Ted Pella, CA	15110-10	Punched hole in PDMS