Een veelzijdige methode van patroonvorming Eiwitten en cellen

Summary

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Abstract

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

Introduction

In weefselengineering en biosensoren, de mogelijkheid om de ruimtelijke organisatie van eiwitten en cellen op een schaal urn besturen, wordt steeds belangrijker in de laatste vier decennia ^{1, 2, 3} worden. Nauwkeurige ruimtelijke organisatie van eiwitten en cellen heeft onderzoekers toegestaan om de interactie tussen cellen en substraten met soortgelijke of verschillende soorten cellen, celgroei leiden en om biomoleculen te immobiliseren voor het vervaardigen van biosensoren ^{4, 5, 6, 7, 8 onderzoeken 9.}

De huidige methoden van patroonvorming eiwitten omvatten photopatterning en microcontact afdrukken. Photopatterning maakt gebruik van lichtgevoelig materiaal dat wordt verknoopt na blootstelling aan Ultreen violet (UV) licht. UV licht gericht op een fotomasker (bestaande uit transparante gebieden met donkerdere gebieden UV lichttransmissie voorkomen) veroorzaakt verknoping in specifieke regio's die vervolgens kunnen worden gebruikt voor verdere bevestiging van biomaterialen of cellen ^{10, 11.} Hoewel dit systeem is zeer nauwkeurig en maakt nauwkeurige regeling van de topografie van het kweekoppervlak, is beperkt tot UV-gevoelige biomoleculen die kunnen worden gevormd door UV-straling ^12. Microcontactprinten is een populaire methode van patroonvorming van specifieke eiwitten ^{13, 14.} In deze werkwijze wordt een poly- dimethylsiloxaan (PDMS) stempel behandeld met verschillende oppervlaktemodificatie reagentia voordat geweekt in een oplossing van het gekozen biomoleculaire substraat. Vervolgens wordt voorzichtig op een glazen dekglaasje of ander oppervlak aldus "stempelen" het biomolecuul op het kweekoppervlak gedrukt. However, stempelen is beperkt tot het type materiaal, dat kan worden overgedragen als de bevochtigbaarheid van biomoleculen aan het oppervlak van het PDMS stempel ^15.

Directe patroonvorming van cellen kan moeilijker zijn en voert complexe methoden zoals omschakelbare substraten, stencil gebaseerde methoden, of modelleren specifieke celadhesiemoleculen ^{16, 17.} Deze methoden zijn beperkt in hun vermogen om cellen patroon door het ontbreken van compatibele celadhesie substraten onverenigbaarheid van het proces te laten werken met gevoelige biologische cellen en beperkingen, inconsistentie te reproduceren patroonvorming en complexiteit van de procedure. Bijvoorbeeld, met schakelbare substraten behoeftedouane substraten worden ontworpen voor elk celtype, om hun hechting aan specifieke celtypen te schakelen zonder afbraak bij blootstelling aan het UV-licht en warmte gebruikt in proces ^17, < sup class = "xref"> ^{18, 19, 20.} Stencil gebaseerde patronen methoden zijn veelzijdig in hun vermogen om patroon cellen; echter, is het moeilijk om PDMS stencils vervaardiging op geschikte dikten voor ^{16, 21.} Directe injectie van cellen in PDMS microkanalen u voordelen zoals: 1) gemak in vervaardiging van microfluïdische kanalen en 2) geschiktheid voor verschillende cellen en substraten. De heersende vraag luchtbel vangen tijdens het injectieproces vanwege de hydrofobiciteit van PDMS zonder gebruik van plasmareiniging, of andere methoden om luchtbellen te verminderen, is het moeilijk om consequent gevormde cellen op glazen of kunststof oppervlakken ²¹ maken.

Dit werk breidt uit op capillaire micromolding ^{22, 23,}lass = "xref"> ^{24, 25, 26} en rapporteert een werkwijze voor eiwit en celsuspensies injecteren in microkanalen. De hier gebruikte methode toont de patronen van substraten en zowel directe als indirecte patroonvorming van specifieke celtypen. Deze techniek overwint de hydrofobiciteit van PDMS en elimineert de aanwezigheid van bellen tijdens het inspuiten van zowel substraten of cellen door gebruik te maken van de gaspermeabiliteit van PDMS ^27. Dit demonstreert het gebruik van de techniek met verschillende substraten en celtypen. Het artikel beschrijft tevens de vervaardiging van vormen voor zachte lithografie onder toepassing van gebruikelijke fotolithografie en een eenvoudige en goedkope plakband werkwijze bruikbaar in omgevingen met beperkte hulpbronnen ^{28, 29.}

Protocol

LET OP: Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor gebruik. Een deel van de chemicaliën die worden gebruikt in dit protocol zijn giftig en kankerverwekkend. Gebruik alle nodige veiligheidsvoorschriften (zuurkast, dashboardkastje) en persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte broek, dichte schoenen) bij het gebruik van giftige of zuur / base materialen. 1. Fabricage van Master mallen voor Soft Lithography gebruik van…

Representative Results

Deze werkwijze maakt de patroonvorming van eiwitten en indirecte patroonvorming van cellen onder toepassing doodlopende microkanalen met afmetingen van slechts 10 urn en machines in bijna alle biologische laboratoria wanneer de kapitein mal gemaakt. Deze techniek kan worden gebruikt met PDMS microkanalen gemaakt met traditionele zachte fotolithografie, of PDMS microfluïdische kanalen gecreëerd met plakband vervaardiging (figuur 1) 28,…

Discussion

Terwijl conventionele fotolithografie is een gevestigde techniek voor het creëren van vormen voor zachte lithografie, uitrusting, materialen en vaardigheden die nodig conventionele fotolithografie gebruiken zijn niet gemakkelijk beschikbaar voor de meeste laboratoria. Laboratorium zonder toegang tot deze middelen hebben we plakband vervaardiging voorgesteld als een methode om matrijzen met relatief eenvoudige functies voor microfluïdische inrichtingen. Deze methode maakt het mogelijk elk laboratorium te creëren en te…

Materials

CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools	Corel Corporation, Canada	X4 Version 14.0.0.701	CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device
Laser Printer HP	Hewlett Packard, CA	1739629	Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique
Bel-Art Dessicator	Fisher Scientific, MA	08-594-16B	Used to degass the PDMS mixture
Adhesive Scotch Tape	3M Product, MN	Tape 600	Used to fabricate adhesive tape Master
PDMS Sylgard 184	Dow Corning, MI	1064291	Casting polymer
Petri Dish	Fisher Scientific, MA	08-772-23	Used to keep the mold to cast with PDMS
Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11)	Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan	2976#11	Used to cut the PDMS
Tweezers	Ted Pella, CA	5627-07	Used to handle the PDMS cast during peeling
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-546-2	Used as surface to pattern the Substrate
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-544-4	Used as surface to pattern the Substrate
Rubber Roller	Dick Blick Art Materials, IL	40104-1004	Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles
Laser Mask Writer	Heidelberg Instruments, Germany	DWL66fs	Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process
EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool)	EV Group, Germany	EVG 620T(B)	Used to expose the photoresist to UV light
Spin Coater Headway	Headway Research Inc, TX	PWM32-PS-CB15PL	Used to spin coat the photoresist on silicon wafer
Photoresists SU-8 50	MicroChem, MA	Y131269	Negative photoresist used for mold fabrication
SU-8 Devloper	MicroChem, MA	Y020100	Photoresist developer
Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane	UCT Specialties, PA	T2492-KG	Coat mold to avoid PDMS adhesion
Isopropanol	Sigma-Aldrich, MO	190764	Cleaning Solvent
Ethanol	Sigma-Aldrich, MO	24102	Sterilization Solvent
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich, MO	P0899-10MG	PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer
Laminin	Sigma-Aldrich, MO	L2020	Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use
BSA	Fisher Scientific, MA	BP1605100	Cell culture
C2C12 Myoblast cell lline	ATCC, VA	CRL-1722	Used to demonstrate C2C12 patterning
PC12 Cell Line	ATCC, VA	CRL-1721	Used to demonstrate PC12 patterning
Collagen type 1, rat tail	BD Biosciences	40236	Cell culture
DMEM	GIBCO, MA	11965-084	Cell culture
Horse Serum, heat inactivated	Fisher Scientific, MA	26050-070	Cell culture
Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC)	Sigma-Aldrich, MO	P1951	To label cells
Calcein-AM live dead cell Assay kit	Invitrogen, MA	L-3224	Cell viability Assay
Biopsy Hole Punch	Ted Pella, CA	15110-10	Punched hole in PDMS