This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.
Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.
ऊतक इंजीनियरिंग और biosensing में, प्रोटीन और एक माइक्रोन पैमाने पर कोशिकाओं के स्थानिक संगठन को नियंत्रित करने की क्षमता है, पिछले चार दशकों से 1, 2, 3 में तेजी से महत्वपूर्ण बन गया है। प्रोटीन और कोशिकाओं की सटीक स्थानिक संगठन, शोधकर्ताओं ने कोशिकाओं और कोशिकाओं के समान या विभिन्न प्रकार युक्त, सेल के विकास का मार्गदर्शन करने के लिए, और biosensors 4, 5, 6, 7, 8 के निर्माण के लिए biomolecules स्थिर करने के लिए substrates के बीच बातचीत की जांच करने की अनुमति दे दी है 9।
patterning प्रोटीन के मौजूदा तरीकों photopatterning और microcontact मुद्रण शामिल हैं। Photopatterning प्रकाश के प्रति संवेदनशील सामग्री है जो ultr के लिए जोखिम पर crosslinked है इस्तेमालएक वायलेट (यूवी) प्रकाश। पराबैंगनी प्रकाश एक photomask (गहरा क्षेत्रों पराबैंगनी प्रकाश संचरण को रोकने के साथ पारदर्शी क्षेत्रों से मिलकर) के निर्देश पर विशिष्ट क्षेत्रों जो तब biomaterials या कोशिकाओं 10, 11 के बाद कुर्की के लिए इस्तेमाल किया जा सकता में crosslinking का कारण बनता है। हालांकि यह योजना बहुत सटीक है और संस्कृति की सतह की स्थलाकृति के सटीक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है, यह यूवी संवेदनशील biomolecules कि पराबैंगनी विकिरण 12 से नमूनों की जा सकती तक सीमित है। Microcontact मुद्रण विशिष्ट प्रोटीन patterning 13, 14 का एक लोकप्रिय तरीका है। इस विधि में, एक पाली डाइमिथाइल siloxane (PDMS) स्टाम्प चुना biomolecular सब्सट्रेट के एक समाधान में भिगो जा रहा से पहले सतह संशोधन अभिकर्मकों की एक किस्म के साथ व्यवहार किया जाता है। यह तो धीरे एक गिलास coverslip या अन्य सतह इस प्रकार संस्कृति सतह पर "मुद्रांकन" बायोमोलिक्यूल पर दबाया जाता है। होwever, मुद्रांकन सामग्री के प्रकार है कि PDMS स्टाम्प 15 सतह के लिए biomolecules के wettability के रूप में भी स्थानांतरित किया जा सकता तक सीमित है।
कोशिकाओं के प्रत्यक्ष patterning और अधिक कठिन हो सकता है और इस तरह के switchable substrates, स्टैंसिल आधारित विधियों, या विशेष सेल आसंजन अणुओं 16, 17 के साथ patterning के रूप में जटिल तरीकों पर निर्भर करता है सकते हैं। इन विधियों संगत कोशिका आसंजन substrates की कमी के कारण पैटर्न कोशिकाओं करने की क्षमता में सीमित कर रहे हैं, इस प्रक्रिया की असंगति संवेदनशील जैविक कोशिकाओं और बाधाओं, patterning reproducing में विसंगति, और प्रक्रिया की जटिलता के साथ काम करने के लिए। उदाहरण के लिए, switchable substrates के साथ, कस्टम substrates पराबैंगनी प्रकाश और गर्मी प्रक्रिया 17 में इस्तेमाल किया, के लिए जोखिम पर गिरावट के बिना विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं को उनके पालन स्विच करने के लिए, हर कोशिका प्रकार के लिए तैयार होने की जरूरत < समर्थन वर्ग = "xref"> 18, 19, 20। स्टैंसिल आधारित patterning तरीकों पैटर्न कोशिकाओं के लिए उनकी क्षमता में बहुमुखी हैं; हालांकि, यह प्रयोग 16, 21 के लिए उपयुक्त मोटाई पर PDMS स्टेंसिल निर्माण करने के लिए मुश्किल है। 1) microfluidic चैनलों के निर्माण में आसानी और 2) कई अलग कक्षों और substrates के लिए उपयुक्तता: PDMS microfluidic चैनलों में कोशिकाओं के प्रत्यक्ष इंजेक्शन के रूप में कुछ फायदे हैं। हालांकि, प्लाज्मा सफाई, या अन्य तरीकों का उपयोग हवा के बुलबुले कम करने के लिए बिना PDMS की hydrophobicity के कारण इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान एयर बबल कब्जा की प्रचलित मुद्दा है, यह मुश्किल लगातार पर कांच या प्लास्टिक की सतहों 21 नमूनों की कोशिकाओं को बनाने के लिए बनाता है।
इस काम केशिका micromolding 22, 23 पर फैलता है,लड़की = "xref"> 24, 25, 26 और microchannels में प्रोटीन और सेल निलंबन इंजेक्षन करने के लिए एक विधि की रिपोर्ट। यहां इस्तेमाल किया विधि substrates के patterning और विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के दोनों प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष patterning को दर्शाता है। इस तकनीक PDMS की उच्च hydrophobicity पर काबू पा और PDMS 27 की गैस पारगम्यता का लाभ लेने से या तो substrates या कोशिकाओं के इंजेक्शन के दौरान बुलबुले की उपस्थिति समाप्त। इस पत्र में कई अलग अलग substrates और प्रकार की कोशिकाओं के साथ तकनीक के उपयोग को दर्शाता है। लेख में यह भी पारंपरिक photolithography के साथ ही एक सरल और कम लागत वाली चिपकने वाला टेप विधि संसाधन में उपयोगी सीमित सेटिंग्स 28, 29 का उपयोग कर नरम लिथोग्राफी के लिए नए नए साँचे के निर्माण पर प्रकाश डाला गया।
जबकि पारंपरिक photolithography नरम लिथोग्राफी, उपकरण, सामग्री, और पारंपरिक photolithography का उपयोग करने के लिए आवश्यक कौशल के लिए नए नए साँचे के निर्माण के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है सबसे प्रयोगशालाओं के लिए आसा…
The authors have nothing to disclose.
इस शोध के लिए अनुदान स्पाइनल कॉर्ड रिसर्च (NJCSCR) (FHK करने के लिए) पर न्यू जर्सी आयोग द्वारा उपलब्ध कराया गया था, CSCR14IRG005 (BLF करने के लिए) के लिए अनुदान, एनआईएच R15NS087501 (सीएचसी), और एफएम किर्बी फाउंडेशन (ईटीए के लिए) अनुदान।
CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools | Corel Corporation, Canada | X4 Version 14.0.0.701 | CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device |
Laser Printer HP | Hewlett Packard, CA | 1739629 | Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique |
Bel-Art Dessicator | Fisher Scientific, MA | 08-594-16B | Used to degass the PDMS mixture |
Adhesive Scotch Tape | 3M Product, MN | Tape 600 | Used to fabricate adhesive tape Master |
PDMS Sylgard 184 | Dow Corning, MI | 1064291 | Casting polymer |
Petri Dish | Fisher Scientific, MA | 08-772-23 | Used to keep the mold to cast with PDMS |
Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11) | Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan | 2976#11 | Used to cut the PDMS |
Tweezers | Ted Pella, CA | 5627-07 | Used to handle the PDMS cast during peeling |
Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-546-2 | Used as surface to pattern the Substrate |
Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-544-4 | Used as surface to pattern the Substrate |
Rubber Roller | Dick Blick Art Materials, IL | 40104-1004 | Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles |
Laser Mask Writer | Heidelberg Instruments, Germany | DWL66fs | Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process |
EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool) | EV Group, Germany | EVG 620T(B) | Used to expose the photoresist to UV light |
Spin Coater Headway | Headway Research Inc, TX | PWM32-PS-CB15PL | Used to spin coat the photoresist on silicon wafer |
Photoresists SU-8 50 | MicroChem, MA | Y131269 | Negative photoresist used for mold fabrication |
SU-8 Devloper | MicroChem, MA | Y020100 | Photoresist developer |
Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane | UCT Specialties, PA | T2492-KG | Coat mold to avoid PDMS adhesion |
Isopropanol | Sigma-Aldrich, MO | 190764 | Cleaning Solvent |
Ethanol | Sigma-Aldrich, MO | 24102 | Sterilization Solvent |
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich, MO | P0899-10MG | PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer |
Laminin | Sigma-Aldrich, MO | L2020 | Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use |
BSA | Fisher Scientific, MA | BP1605100 | Cell culture |
C2C12 Myoblast cell lline | ATCC, VA | CRL-1722 | Used to demonstrate C2C12 patterning |
PC12 Cell Line | ATCC, VA | CRL-1721 | Used to demonstrate PC12 patterning |
Collagen type 1, rat tail | BD Biosciences | 40236 | Cell culture |
DMEM | GIBCO, MA | 11965-084 | Cell culture |
Horse Serum, heat inactivated | Fisher Scientific, MA | 26050-070 | Cell culture |
Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC) | Sigma-Aldrich, MO | P1951 | To label cells |
Calcein-AM live dead cell Assay kit | Invitrogen, MA | L-3224 | Cell viability Assay |
Biopsy Hole Punch | Ted Pella, CA | 15110-10 | Punched hole in PDMS |