Un metodo versatile di patterning proteine ​​e cellule

Summary

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Abstract

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

Introduction

In ingegneria dei tessuti e biosensori, la capacità di controllare l'organizzazione spaziale delle proteine e cellule su scala micron, è diventato sempre più importante negli ultimi quarant'anni ^{1, 2, 3.} Precise organizzazione spaziale delle proteine e cellule ha permesso ai ricercatori di esaminare l'interazione tra cellule e substrati contenenti tipi simili o diversi di cellule, per guidare la crescita cellulare, e immobilizzare biomolecole per la fabbricazione di biosensori ^{4, 5, 6, 7, 8, 9.}

Gli attuali metodi di proteine ​​patterning includono photopatterning e stampa microcontact. Photopatterning utilizza materiale sensibile alla luce, che viene reticolato in seguito all'esposizione ad ultruna viola (UV). Luce UV diretta a un fotomaschera (costituito da aree trasparenti con le regioni più scure per prevenire la trasmissione della luce UV) provoca la reticolazione in regioni specifiche che possono poi essere utilizzati per successivo fissaggio dei biomateriali o celle ^{10, 11.} Mentre questo schema è molto preciso e consente un controllo preciso della topografia della superficie cultura, è limitato a biomolecole sensibili ai raggi UV che possono essere modellati da radiazione UV ^12. Stampa microcontact è un altro metodo popolare di patterning proteine specifiche ^{13, 14.} In questo metodo, un silossano (PDMS) timbro poli-dimetil viene trattata con una varietà di reagenti modifica della superficie prima di essere stati immersi in una soluzione del substrato biomolecolare prescelto. E 'poi delicatamente pressato su un vetrino di vetro o di altra superficie così "stamping" biomolecole sulla superficie cultura. However, stampaggio è limitata al tipo di materiale che può essere trasferito, nonche la bagnabilità di biomolecole alla superficie del timbro PDMS ^15.

Patterning diretto delle cellule può essere più difficile e si basa su metodi complessi come substrati commutabili, metodi basati stencil, o patterning con specifiche molecole di adesione cellulare ^{16, 17.} Questi metodi sono limitati nella loro capacità di cellule modello a causa della mancanza di substrati di adesione cellulare compatibili, incompatibilità del processo di lavorare con cellule sensibili biologiche e vincoli, incoerenza nel riprodurre il patterning e complessità della procedura. Ad esempio, con i substrati commutabile, substrati personalizzati devono essere progettati per ogni tipo di cellula, per passare la loro adesione a specifici tipi cellulari senza degradazione per esposizione alla luce UV e calore utilizzato nel processo ^17, < class = sup "xref"> ^{18, 19, 20.} metodi di patterning basata Stencil sono versatili nella loro capacità di cellule del modello; Tuttavia, è difficile produrre matrici PDMS a spessori adeguati per l'utilizzo ^{16, 21.} L'iniezione diretta di cellule in canali microfluidica PDMS hanno alcuni vantaggi quali: 1) facilità di fabbricazione di canali microfluidica e 2) di idoneità per molte cellule e substrati diversi. Tuttavia, il problema prevalente di cattura bolla d'aria durante il processo di iniezione a causa della idrofobicità del PDMS senza l'uso di pulizia al plasma, o altri metodi per ridurre bolle d'aria, rende difficile creare costantemente cellule modellata su superfici di vetro o di plastica ^21.

Questo lavoro si espande su capillare micromolding ^{22, 23,}lass = "xref"> ^{24, 25, 26} e riporta un metodo per iniettare proteine e cellule sospensioni in microcanali. Il metodo utilizzato qui dimostra la patterning dei substrati ed entrambi patterning diretto e indiretto di specifici tipi cellulari. Questa tecnica supera l'elevata idrofobicità di PDMS ed elimina la presenza di bolle durante l'iniezione del substrato o da cellule sfruttando la permeabilità ai gas di PDMS ^27. Questo documento dimostra l'uso della tecnica con diversi substrati diversi e tipi di cellule. L'articolo evidenzia anche la fabbricazione di stampi per la litografia morbido utilizzando la fotolitografia convenzionale nonché una semplice ed adesivo a basso costo metodo nastro utile risorse limitate impostazioni ^{28, 29.}

Protocol

NOTA: Si prega di consultare tutte le schede di sicurezza materiale pertinente (MSDS) prima dell'uso. Alcune delle sostanze chimiche utilizzate in questo protocollo sono tossici e cancerogeni. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza adeguati (cappa, cassetto portaoggetti) e dispositivi di protezione individuale (occhiali, guanti, camice da laboratorio, pantaloni a figura intera, scarpe chiuse) quando si usano materiali tossici o acido / base. 1. Realizzazione del Maestro Stam…

Representative Results

Questo metodo consente di patterning di proteine ​​e patterning indiretta di cellule utilizzando dead-end canali microfluidica con dimensioni piccole come 10 micron e le attrezzature disponibili in quasi tutti i laboratori biologici una volta lo stampo maestro è fatto. Questa tecnica può essere utilizzata con canali microfluidici PDMS creata usando fotolitografia tradizionali morbido, o con canali microfluidici PDMS creati con nastro adesivo di fabbricazione (Figura 1)</str…

Discussion

Mentre fotolitografia convenzionale è una tecnica ben consolidata per la realizzazione di stampi per litografia soft, attrezzature, materiali e competenze necessarie per utilizzare fotolitografia convenzionale non sono facilmente disponibili al maggior parte dei laboratori. Per i laboratori senza accesso a queste risorse, abbiamo presentato adesivo fabbricazione nastro come un metodo per creare stampi con caratteristiche relativamente semplici per dispositivi microfluidici. Questo metodo permette qualsiasi laboratorio …

Materials

CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools	Corel Corporation, Canada	X4 Version 14.0.0.701	CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device
Laser Printer HP	Hewlett Packard, CA	1739629	Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique
Bel-Art Dessicator	Fisher Scientific, MA	08-594-16B	Used to degass the PDMS mixture
Adhesive Scotch Tape	3M Product, MN	Tape 600	Used to fabricate adhesive tape Master
PDMS Sylgard 184	Dow Corning, MI	1064291	Casting polymer
Petri Dish	Fisher Scientific, MA	08-772-23	Used to keep the mold to cast with PDMS
Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11)	Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan	2976#11	Used to cut the PDMS
Tweezers	Ted Pella, CA	5627-07	Used to handle the PDMS cast during peeling
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-546-2	Used as surface to pattern the Substrate
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-544-4	Used as surface to pattern the Substrate
Rubber Roller	Dick Blick Art Materials, IL	40104-1004	Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles
Laser Mask Writer	Heidelberg Instruments, Germany	DWL66fs	Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process
EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool)	EV Group, Germany	EVG 620T(B)	Used to expose the photoresist to UV light
Spin Coater Headway	Headway Research Inc, TX	PWM32-PS-CB15PL	Used to spin coat the photoresist on silicon wafer
Photoresists SU-8 50	MicroChem, MA	Y131269	Negative photoresist used for mold fabrication
SU-8 Devloper	MicroChem, MA	Y020100	Photoresist developer
Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane	UCT Specialties, PA	T2492-KG	Coat mold to avoid PDMS adhesion
Isopropanol	Sigma-Aldrich, MO	190764	Cleaning Solvent
Ethanol	Sigma-Aldrich, MO	24102	Sterilization Solvent
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich, MO	P0899-10MG	PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer
Laminin	Sigma-Aldrich, MO	L2020	Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use
BSA	Fisher Scientific, MA	BP1605100	Cell culture
C2C12 Myoblast cell lline	ATCC, VA	CRL-1722	Used to demonstrate C2C12 patterning
PC12 Cell Line	ATCC, VA	CRL-1721	Used to demonstrate PC12 patterning
Collagen type 1, rat tail	BD Biosciences	40236	Cell culture
DMEM	GIBCO, MA	11965-084	Cell culture
Horse Serum, heat inactivated	Fisher Scientific, MA	26050-070	Cell culture
Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC)	Sigma-Aldrich, MO	P1951	To label cells
Calcein-AM live dead cell Assay kit	Invitrogen, MA	L-3224	Cell viability Assay
Biopsy Hole Punch	Ted Pella, CA	15110-10	Punched hole in PDMS