En allsidig Måte mønster Proteiner og celler

Summary

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Abstract

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

Introduction

I tissue engineering og biosensing, evnen til å kontrollere den romlige organiseringen av proteiner og celler på en skala um, er blitt mer og mer viktig i løpet av de siste fire tiår ^{1, 2, 3.} Presis romlig organisering av proteiner og celler har tillatt forskere å undersøke interaksjonen mellom celler og substrater som inneholder samme eller forskjellige typer av celler, for å lede cellevekst, og for å immobilisere biomolekyler for fremstillingen av biosensorer, ^{4, 5, 6, 7, 8, 9.}

Aktuelle metoder for mønster proteiner inkluderer photopatterning og mikro utskrift. Photopatterning anvender lysfølsomme materiale som er tverrbundet ved eksponering for Ultren fiolett (UV) lys. UV-lys rettet mot en fotomaske (bestående av gjennomsiktige områder med mørkere regioner for å hindre UV-lystransmisjon) forårsaker tverrbinding i bestemte regioner som deretter kan anvendes for etterfølgende festing av biomaterialer eller celler ^{10, 11.} Mens denne ordningen er svært nøyaktig og gir mulighet for nøyaktig kontroll av topografien av kulturen overflaten, er det begrenset til UV-sensitive biomolekyler som kan mønstrede av UV-stråling ^12. Mikro utskrift er en annen populær metode for mønstring spesifikke proteiner ^{13, 14.} I denne fremgangsmåten blir et poly-dimetyl siloksan (PDMS) stempel ble behandlet med en rekke forskjellige overflatemodifiserende reagenser før de ble dyppet i en oppløsning av den valgte biomolekylære substratet. Den ble deretter forsiktig presset på et glass dekkglass eller en annen overflate dermed "stempling" av biomolekyler på kulturoverflaten. However, er stempling begrenset til den type materiale som kan overføres i tillegg til fukting av biomolekyler til overflaten av PDMS stempel ^15.

Direkte fordelingen av cellene kan være mer vanskelig og er avhengig av kompliserte metoder som svitsjbare substrater, sjablong baserte metoder eller mønstre med spesifikke celleadhesjonsmolekyler ^{16, 17.} Disse metodene er begrenset i deres evne til mønster-celler på grunn av mangel på kompatible celle adhesjon substrater, til uforlikelighet av fremgangsmåten arbeider med sensitive biologiske celler og begrensninger, inkonsistens i gjengi mønster, og kompleksiteten av prosedyren. For eksempel, med valgbar substrater, tilpasset underlag må være utformet for hver celletype, for å bytte sin tilslutning til spesifikke celletyper uten nedbrytning ved eksponering for UV-lys og varme som brukes i fremgangsmåten ^17, < sup class = "xref"> ^{18, 19, 20.} Sjablong basert mønstringsmetoder er allsidig i sin evne til mønster celler; Det er imidlertid vanskelig å fremstille PDMS sjablonger på de hensiktsmessige tykkelser for bruk ^{16, 21.} Direkte injeksjon av celler i PDMS microfluidic kanaler har noen fordeler som for eksempel: 1) lette i fabrikasjon av microfluidic kanaler og 2) egnethet for mange ulike celler og underlag. Imidlertid er utbredt problemet med luftboble-fangst under sprøyteprosessen på grunn av hydrofobisiteten til PDMS uten bruk av plasma rengjøring, eller andre metoder for å redusere luftbobler, gjør det vanskelig å lage mønstret gående celler på glass- eller plastoverflater ^21.

Dette arbeidet bygger videre kapillær micromolding ^{22, 23,}lass = "xref"> ^{24, 25, 26} og rapporterer en metode for å injisere protein og cellesuspensjoner i mikro. Den brukes her metoden viser fordelingen av underlag og både direkte og indirekte fordelingen av spesifikke celletyper. Denne teknikk overvinner den høye hydrofobisitet av PDMS og eliminerer tilstedeværelsen av bobler under injeksjon av enten substrater eller celler ved å utnytte gass permeabiliteten av PDMS ^27. Dette dokumentet viser bruken av teknikken med flere forskjellige substrater og celletyper. Artikkelen fremhever også ved fremstilling av støpeformer for myk litografi ved anvendelse av konvensjonell fotolitografi, samt en enkel og billig klebebånd metode som er nyttig i ressurs begrensede innstillinger ^{28, 29.}

Protocol

MERK: Ta kontakt med alle relevante sikkerhetsdatablad (MSDS) før bruk. Noen av kjemikaliene som brukes i denne protokollen er giftige og kreftfremkallende. Vennligst bruk alle nødvendige sikkerhetsrutiner (avtrekkshette, hanskerom) og personlig verneutstyr (vernebriller, hansker, lab frakk, full lengde bukser, lukket-toe sko) ved bruk av giftige eller syre / base materialer. 1. Fabrikasjon av Master Former for Soft Litografi bruker Fotolitografi Tegn utformingen av microchannel…

Representative Results

Denne metoden gjør at fordelingen av proteiner og indirekte fordelingen av celler ved hjelp av dead-end microfluidic kanaler med dimensjoner så små som 10 mikrometer og utstyr tilgjengelig i nesten alle biologiske laboratorier gang master mold er gjort. Denne teknikken kan benyttes med PDMS microfluidic kanaler som er opprettet ved hjelp av tradisjonell myk fotolitografi, eller med PDMS microfluidic kanaler som er opprettet med teip fabrikasjon (figur 1) <sup class="x…

Discussion

Mens konvensjonell fotolitografi er en veletablert teknikk for etablering av støpeformer for myk litografi, utstyr, materialer og ferdigheter som er nødvendige for å bruke vanlig fotolitografi er ikke lett tilgjengelig for de fleste laboratorier. For laboratorier uten tilgang til disse ressursene, har vi presentert teip fabrikasjon som en metode for å skape former med relativt enkle funksjoner for microfluidic enheter. Denne metoden lar enhver laboratorium for å skape og utnytte microfluidic enheter for forskningsf…

Materials

CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools	Corel Corporation, Canada	X4 Version 14.0.0.701	CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device
Laser Printer HP	Hewlett Packard, CA	1739629	Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique
Bel-Art Dessicator	Fisher Scientific, MA	08-594-16B	Used to degass the PDMS mixture
Adhesive Scotch Tape	3M Product, MN	Tape 600	Used to fabricate adhesive tape Master
PDMS Sylgard 184	Dow Corning, MI	1064291	Casting polymer
Petri Dish	Fisher Scientific, MA	08-772-23	Used to keep the mold to cast with PDMS
Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11)	Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan	2976#11	Used to cut the PDMS
Tweezers	Ted Pella, CA	5627-07	Used to handle the PDMS cast during peeling
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-546-2	Used as surface to pattern the Substrate
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-544-4	Used as surface to pattern the Substrate
Rubber Roller	Dick Blick Art Materials, IL	40104-1004	Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles
Laser Mask Writer	Heidelberg Instruments, Germany	DWL66fs	Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process
EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool)	EV Group, Germany	EVG 620T(B)	Used to expose the photoresist to UV light
Spin Coater Headway	Headway Research Inc, TX	PWM32-PS-CB15PL	Used to spin coat the photoresist on silicon wafer
Photoresists SU-8 50	MicroChem, MA	Y131269	Negative photoresist used for mold fabrication
SU-8 Devloper	MicroChem, MA	Y020100	Photoresist developer
Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane	UCT Specialties, PA	T2492-KG	Coat mold to avoid PDMS adhesion
Isopropanol	Sigma-Aldrich, MO	190764	Cleaning Solvent
Ethanol	Sigma-Aldrich, MO	24102	Sterilization Solvent
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich, MO	P0899-10MG	PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer
Laminin	Sigma-Aldrich, MO	L2020	Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use
BSA	Fisher Scientific, MA	BP1605100	Cell culture
C2C12 Myoblast cell lline	ATCC, VA	CRL-1722	Used to demonstrate C2C12 patterning
PC12 Cell Line	ATCC, VA	CRL-1721	Used to demonstrate PC12 patterning
Collagen type 1, rat tail	BD Biosciences	40236	Cell culture
DMEM	GIBCO, MA	11965-084	Cell culture
Horse Serum, heat inactivated	Fisher Scientific, MA	26050-070	Cell culture
Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC)	Sigma-Aldrich, MO	P1951	To label cells
Calcein-AM live dead cell Assay kit	Invitrogen, MA	L-3224	Cell viability Assay
Biopsy Hole Punch	Ted Pella, CA	15110-10	Punched hole in PDMS