Um método versátil de padronização proteínas e células

Summary

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Abstract

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

Introduction

Em engenharia de tecidos e biosensing, a capacidade de controlar a organização espacial de proteínas e células em uma escala um, tornou-se cada vez mais importante ao longo das últimas quatro décadas ^{1, 2, 3.} Organização espacial precisa de proteínas e células tem permitido aos pesquisadores examinar a interação entre as células e os substratos que contêm tipos semelhantes ou diferentes de células, para orientar o crescimento celular, e para imobilizar biomoléculas para a fabricação de biossensores ^{4, 5, 6, 7, 8, 9.}

Os métodos atuais de proteínas padronização incluem photopatterning e impressão microcontact. Photopatterning utiliza material sensível à luz que é reticulado por exposição a ultruma violeta (UV). Luz UV dirigida a uma fotomáscara (consistindo em áreas transparentes com regiões mais escuras para evitar a transmissão de luz UV) provoca reticulação em regiões específicas que podem então ser utilizados para a subsequente ligação de biomateriais ou células ^{10, 11.} Embora este esquema é muito preciso e permite o controle preciso da topografia da superfície da cultura, é limitada a biomoléculas sensíveis aos raios UV, que pode ser modelado por radiação UV ^12. Impressão microcontact é outro método popular de padronização proteínas específicas ^{13, 14.} Neste método, um siloxano (PDMS) selo poli-dimetil é tratada com uma variedade de reagentes de modificação da superfície antes de ser embebido numa solução de substrato escolhido biomolecular. Em seguida, é suavemente pressionado para uma lamela de vidro ou outra superfície assim "estampagem" a biomolécula sobre a superfície da cultura. HoWever, estampagem se limita ao tipo de material que pode ser transferido assim como a molhabilidade de biomoléculas à superfície do PDMS selo ^15.

Padronização directa de células pode ser mais difícil e baseia-se em métodos de complexos, tais como substratos comutáveis, métodos com base estêncil, ou modelação com moléculas de adesão celular específicos ^{16, 17.} Estes métodos estão limitados na sua capacidade de células de teste padrão, devido à falta de substratos de adesão celular compatíveis, a incompatibilidade do processo para o trabalho com células sensíveis biológicos e constrangimentos, inconsistência em reproduzir o padrão e a complexidade do processo. Por exemplo, substratos com comutáveis, substratos mercadorias necessitam de ser concebido para cada tipo de célula, para mudar a sua adesão a tipos específicos de células, sem a degradação por exposição à luz UV e calor usado no processo ^17, < classe sup = "xref"> ^{18, 19, 20.} Estêncil métodos de padronização com base são versáteis em sua capacidade de células padrão; No entanto, é difícil fabricar matrizes PDMS nas espessuras adequadas para utilização ^{16, 21.} injeção direta de células em canais microfluídicos PDMS tem algumas vantagens, tais como: 1) facilidade na fabricação de canais microfluídicos e 2) adequação para muitas células e diferentes substratos. No entanto, o problema predominante de captura de bolhas de ar durante o processo de injecção devido à hidrofobicidade dos PDMS sem o uso de limpeza de plasma, ou outros métodos para diminuir as bolhas de ar, faz com que seja difícil criar consistentemente células modelado sobre superfícies de vidro ou de plástico ^21.

Este trabalho expande micromolding capilar ^{22, 23,}lass = "refex"> ^{24, 25, 26} e relata um método para injectar suspensões de células de proteína e em microcanais. O método utilizado aqui demonstra a padronização de substratos e ambos padronização direta e indireta de tipos específicos de células. Esta técnica ultrapassa a elevada hidrofobicidade de PDMS e elimina a presença de bolhas durante a injecção quer de substratos ou células, tirando proveito da permeabilidade aos gases de PDMS ^27. Este documento revela a utilização da técnica com vários substratos diferentes e tipos de células. O artigo também destaca a fabricação de moldes para litografia macia usando fotolitografia convencional, bem como um método simples e adesivo de baixo custo tape útil em recursos configurações limitadas ^{28, 29.}

Protocol

NOTA: Por favor, consulte todas as folhas de dados de segurança pertinentes (MSDS) antes do uso. Alguns dos produtos químicos utilizados no presente protocolo são tóxicos e cancerígenos. Por favor, use todas as práticas de segurança adequadas (extractor de fumo, porta-luvas) e equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calça de corpo inteiro, sapatos fechados) ao utilizar materiais tóxicos ou ácido / base. 1. Fabricação de Mestre Moldes para macio …

Representative Results

Este método permite a padronização de proteínas e padronização indireta de células usando canais microfluídicos sem saída com dimensões tão pequenas quanto 10 mm e equipamentos disponíveis em quase todos os laboratórios biológicos uma vez que o molde mestre é feita. Esta técnica pode ser utilizada com canais microfluídicos PDMS criados usando fotolitografia suave tradicional, ou com canais microfluídicos PDMS criadas com fita adesiva de fabricação (Figura 1)</…

Discussion

Enquanto fotolitografia convencional é uma técnica bem estabelecida para a realização de moldes de litografia macia, o equipamento, materiais, e as competências necessárias para utilizar fotolitografia convencional não estão prontamente disponíveis para a maioria dos laboratórios. Para laboratórios que não têm acesso a esses recursos, nós apresentamos a fabricação de fita adesiva como um método de criação de moldes com características relativamente simples para dispositivos microfluídicos. Este mét…

Materials

CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools	Corel Corporation, Canada	X4 Version 14.0.0.701	CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device
Laser Printer HP	Hewlett Packard, CA	1739629	Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique
Bel-Art Dessicator	Fisher Scientific, MA	08-594-16B	Used to degass the PDMS mixture
Adhesive Scotch Tape	3M Product, MN	Tape 600	Used to fabricate adhesive tape Master
PDMS Sylgard 184	Dow Corning, MI	1064291	Casting polymer
Petri Dish	Fisher Scientific, MA	08-772-23	Used to keep the mold to cast with PDMS
Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11)	Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan	2976#11	Used to cut the PDMS
Tweezers	Ted Pella, CA	5627-07	Used to handle the PDMS cast during peeling
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-546-2	Used as surface to pattern the Substrate
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-544-4	Used as surface to pattern the Substrate
Rubber Roller	Dick Blick Art Materials, IL	40104-1004	Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles
Laser Mask Writer	Heidelberg Instruments, Germany	DWL66fs	Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process
EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool)	EV Group, Germany	EVG 620T(B)	Used to expose the photoresist to UV light
Spin Coater Headway	Headway Research Inc, TX	PWM32-PS-CB15PL	Used to spin coat the photoresist on silicon wafer
Photoresists SU-8 50	MicroChem, MA	Y131269	Negative photoresist used for mold fabrication
SU-8 Devloper	MicroChem, MA	Y020100	Photoresist developer
Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane	UCT Specialties, PA	T2492-KG	Coat mold to avoid PDMS adhesion
Isopropanol	Sigma-Aldrich, MO	190764	Cleaning Solvent
Ethanol	Sigma-Aldrich, MO	24102	Sterilization Solvent
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich, MO	P0899-10MG	PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer
Laminin	Sigma-Aldrich, MO	L2020	Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use
BSA	Fisher Scientific, MA	BP1605100	Cell culture
C2C12 Myoblast cell lline	ATCC, VA	CRL-1722	Used to demonstrate C2C12 patterning
PC12 Cell Line	ATCC, VA	CRL-1721	Used to demonstrate PC12 patterning
Collagen type 1, rat tail	BD Biosciences	40236	Cell culture
DMEM	GIBCO, MA	11965-084	Cell culture
Horse Serum, heat inactivated	Fisher Scientific, MA	26050-070	Cell culture
Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC)	Sigma-Aldrich, MO	P1951	To label cells
Calcein-AM live dead cell Assay kit	Invitrogen, MA	L-3224	Cell viability Assay
Biopsy Hole Punch	Ted Pella, CA	15110-10	Punched hole in PDMS