Un método versátil de Patterning proteínas y células

Summary

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Abstract

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

Introduction

En la ingeniería de tejidos y biosensores, la capacidad de controlar la organización espacial de las proteínas y células en una escala de micras, se ha convertido cada vez más importante en los últimos cuatro décadas ^{1, 2, 3.} Organización espacial precisa de las proteínas y células ha permitido a los investigadores examinar la interacción entre las células y sustratos que contienen tipos similares o diferentes de células, para guiar el crecimiento celular, y para inmovilizar biomoléculas para la fabricación de biosensores ^{4, 5, 6, 7, 8, 9.}

Los métodos actuales de proteínas de modelado incluyen photopatterning y la impresión por microcontacto. Photopatterning utiliza material sensible a la luz que se entrecruza con la exposición a ultruna violeta (UV). Luz UV dirigida a una fotomáscara (que consta de zonas transparentes con regiones más oscuras para prevenir la transmisión de luz UV) provoca reticulación en regiones específicas que luego se pueden utilizar para la unión subsiguiente de los biomateriales o células ^{10, 11.} Aunque este esquema es muy precisa y permite un control preciso de la topografía de la superficie de cultivo, que se limita a biomoléculas sensibles a UV que pueden ser modeladas por la radiación UV ^12. La impresión por microcontacto es otro método popular de proteínas específicas modelando ^{13, 14.} En este método, un siloxano (PDMS) sello de poli-dimetil se trata con una variedad de reactivos de modificación de la superficie antes de ser sumergida en una solución del sustrato biomolecular elegido. A continuación, se presiona suavemente sobre un cubreobjetos de vidrio u otra superficie de este modo el "sacrificio" de la biomolécula sobre la superficie de cultivo. HoWever, estampado se limita al tipo de material que puede ser transferida, así como la humectabilidad de las biomoléculas a la superficie de los PDMS sello ^15.

Patrón directa de las células puede ser más difícil y se basa en métodos complejos tales como sustratos conmutables, métodos basados en la plantilla, o patrones con las moléculas de adhesión celular específicos ^{16, 17.} Estos métodos están limitados en su capacidad de células de patrón debido a la falta de sustratos de adhesión celular compatibles, incompatibilidad de que el proceso funcione con células sensibles biológicos y limitaciones, la inconsistencia en la reproducción del patrón, y la complejidad del procedimiento. Por ejemplo, con sustratos conmutables, sustratos personalizados necesitan ser diseñadas para cada tipo de célula, para cambiar su adhesión a tipos celulares específicos sin la degradación a la exposición a la luz UV y calor usado en proceso ^17, < SUP = "xref"> ^{18, 19, 20.} procedimientos de modelado en base de la plantilla son versátiles en su capacidad de células de patrón; sin embargo, es difícil de fabricar plantillas de PDMS en los espesores adecuados para uso ^{16, 21.} La inyección directa de células en los canales de microfluidos PDMS tiene algunas ventajas, tales como: 1) la facilidad de fabricación de canales de microfluidos y 2) de idoneidad para muchas células y sustratos diferentes. Sin embargo, el problema frecuente de la captura de burbujas de aire durante el proceso de inyección debido a la hidrofobicidad de PDMS sin el uso de limpieza de plasma, u otros métodos para reducir las burbujas de aire, hace que sea difícil crear consistentemente células modelados en el vidrio o de plástico superficies ^21.

Este trabajo amplía micromoldeo capilar ^{22, 23,}lass = "xref"> ^{24, 25, 26} y reporta un método para inyectar proteínas celulares y suspensiones en microcanales. El método utilizado aquí demuestra el patrón de sustratos y ambos patrones directa e indirecta de determinados tipos de células. Esta técnica supera la alta hidrofobicidad de PDMS y elimina la presencia de burbujas durante la inyección de cualquiera de los sustratos o las células mediante el aprovechamiento de la permeabilidad al gas de PDMS ^27. Este documento muestra el uso de la técnica con varios sustratos diferentes y tipos de células. El artículo también destaca la fabricación de moldes para la litografía blanda usando fotolitografía convencional, así como un adhesivo simple y de bajo costo método de la cinta útil en entornos con recursos limitados ^{28, 29.}

Protocol

NOTA: Por favor, consulte a todas las hojas de datos de seguridad de materiales pertinentes (MSDS) antes de usar. Algunos de los productos químicos utilizados en este protocolo son tóxicos y cancerígenos. Por favor, use todas las prácticas de seguridad apropiadas (campana de humos, guantera) y equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos, zapatos cerrados) cuando se utilizan materiales tóxicos o ácido / base. 1. La fabricación de mo…

Representative Results

Este método permite que el patrón de proteínas y patrones indirecta de células usando sin salida canales de microfluidos con dimensiones tan pequeñas como 10 micras y equipo disponible en casi todos los laboratorios biológicos una vez que se hizo el molde maestro. Esta técnica se puede utilizar con los canales de microfluidos PDMS creados usando fotolitografía tradicional suave, o con canales de microfluidos PDMS creadas con cinta adhesiva de fabricación (Figura 1)</stro…

Discussion

Mientras que la fotolitografía convencional es una técnica bien establecida para la realización de moldes de litografía blanda, el equipo, los materiales y las habilidades necesarias para utilizar la fotolitografía convencional no están fácilmente disponibles para la mayoría de los laboratorios. Para los laboratorios que no tienen acceso a estos recursos, hemos presentado la fabricación de cinta adhesiva como un método de creación de moldes con características relativamente simples para dispositivos de micro…

Materials

CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools	Corel Corporation, Canada	X4 Version 14.0.0.701	CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device
Laser Printer HP	Hewlett Packard, CA	1739629	Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique
Bel-Art Dessicator	Fisher Scientific, MA	08-594-16B	Used to degass the PDMS mixture
Adhesive Scotch Tape	3M Product, MN	Tape 600	Used to fabricate adhesive tape Master
PDMS Sylgard 184	Dow Corning, MI	1064291	Casting polymer
Petri Dish	Fisher Scientific, MA	08-772-23	Used to keep the mold to cast with PDMS
Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11)	Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan	2976#11	Used to cut the PDMS
Tweezers	Ted Pella, CA	5627-07	Used to handle the PDMS cast during peeling
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-546-2	Used as surface to pattern the Substrate
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-544-4	Used as surface to pattern the Substrate
Rubber Roller	Dick Blick Art Materials, IL	40104-1004	Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles
Laser Mask Writer	Heidelberg Instruments, Germany	DWL66fs	Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process
EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool)	EV Group, Germany	EVG 620T(B)	Used to expose the photoresist to UV light
Spin Coater Headway	Headway Research Inc, TX	PWM32-PS-CB15PL	Used to spin coat the photoresist on silicon wafer
Photoresists SU-8 50	MicroChem, MA	Y131269	Negative photoresist used for mold fabrication
SU-8 Devloper	MicroChem, MA	Y020100	Photoresist developer
Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane	UCT Specialties, PA	T2492-KG	Coat mold to avoid PDMS adhesion
Isopropanol	Sigma-Aldrich, MO	190764	Cleaning Solvent
Ethanol	Sigma-Aldrich, MO	24102	Sterilization Solvent
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich, MO	P0899-10MG	PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer
Laminin	Sigma-Aldrich, MO	L2020	Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use
BSA	Fisher Scientific, MA	BP1605100	Cell culture
C2C12 Myoblast cell lline	ATCC, VA	CRL-1722	Used to demonstrate C2C12 patterning
PC12 Cell Line	ATCC, VA	CRL-1721	Used to demonstrate PC12 patterning
Collagen type 1, rat tail	BD Biosciences	40236	Cell culture
DMEM	GIBCO, MA	11965-084	Cell culture
Horse Serum, heat inactivated	Fisher Scientific, MA	26050-070	Cell culture
Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC)	Sigma-Aldrich, MO	P1951	To label cells
Calcein-AM live dead cell Assay kit	Invitrogen, MA	L-3224	Cell viability Assay
Biopsy Hole Punch	Ted Pella, CA	15110-10	Punched hole in PDMS