フルーツフライで免疫染色でステロイド合成器官とそのインタラクティブ臓器を可視化するためのプロトコル<em>キイロショウジョウバエ</em
Summary
私たちは、解剖、固定、およびステロイドホルモンの生合成とその調節機構を研究するために、ショウジョウバエの幼虫と大人の女性のステロイド産生器官の免疫染色のためのプロトコルを記述します。ステロイド産生臓器に加えて、我々は、ステロイド産生器官の神経支配並びにそのような生殖細胞系列幹細胞のようなステロイド産生標的細胞を可視化します。
Abstract
多細胞生物では、細胞の小グループは、成長と再生への全身応答を誘導する、その生物起源の活動の専門機能に恵まれています。昆虫で、幼虫の前胸腺（PG）と、成人女性の卵巣プレイエクジステロイドと呼ばれる主要なステロイドホルモンの生合成における重要な役割。これらのecdysteroidogenic器官は生合成のタイミングは、環境手がかりに影響され、それを通して神経系から神経支配されています。ここでは、ステロイドホルモンの生合成とその調節機構を研究するための適切なモデルシステムを提供キイロショウジョウバエを 、飛ぶecdysteroidogenic臓器や幼虫でのインタラクティブな臓器や果物の大人を可視化するためのプロトコルを記述します。巧みな解剖は、私たちは脳、腹側神経索、および他の組織を含むecdysteroidogenic臓器とそのインタラクティブな臓器の位置を維持することができます。を用いた免疫染色ecdysteroidogenic酵素に対するntibodiesは、組織特異的プロモーターにより駆動されるトランスジェニック蛍光タンパク質と共に、ecdysteroidogenic細胞を標識するために利用可能です。また、ecdysteroidogenic器官の神経支配はまた、特異的抗体又はニューロンの様々なタイプのGAL4ドライバーの集合によって標識することができます。したがって、ecdysteroidogenic器官およびそれらの神経接続は、免疫染色およびトランスジェニック技術によって同時に可視化することができます。最後に、我々は、その増殖とメンテナンスエクジステロイドによって制御されている生殖細胞系列幹細胞を、視覚化する方法について説明します。この方法は、ステロイドホルモンの生合成とその神経調節機構の総合的な理解に貢献しています。
Introduction
多細胞生物では、細胞の集団は、体全体のために不可欠である彼らの生体活動の専門機能に恵まれています。その任務を果たすために、各組織または器官は、それらの機能に関連する遺伝子のシリーズを発現し、開発のコンテキスト内でそれらの活性を編成するために他の組織と通信します。このような特殊な細胞機能およびインター器官相互作用を特徴づけるために、我々は、細胞の他のタイプの多アーキテクチャにそのまま保持されると共にセルのグループを指定する必要があります。
そのような特殊な器官の一例は、多くの生合成酵素が活性ステロイドホルモン1にコレステロールから変換ステップを仲介ステロイド産生器官です。これらの酵素の遺伝子のほとんどは、特にステロイドの器官で発現され、生合成経路がしっかり体液入力とニューロンの入力を介して多くの外部刺激により調節されます。一度合成、ステロイドホルモンは、体液中に分泌され、遺伝子2の種々の発現を調節するため、多くの組織および器官を標的とします。したがって、ステロイドホルモンの作用は、恒常性、成長、および再生を維持するためのシステム応答を誘導します。
ステロイドホルモン生合成の機能及びステロイドホルモンの多面的な行動を調査するために、 キイロショウジョウバエは、適切なモデル系として利用することができます。幼虫の段階では、昆虫ステロイドホルモン、エクジステロイドは、専門的な内分泌器官で生合成される前胸腺（PG）3と呼ばれます。 PGでは、いくつかのecdysteroidogenic酵素は、具体的には、適切な発達段階4に脱皮および変態制御する、エクジソンにコレステロールから複数の変換ステップを触媒します。したがって、エクジステロイド力価の動的変化が規制されています環境合図に応答して、多くのシグナル伝達経路によって。一方、成人の段階では、エクジステロイドは、再生、睡眠、メモリ、および寿命5、6、7、8を含む生理学における重要な役割を果たしています。エクジステロイドが積極卵形成6、7、8、9、10、11の進行を調節する、卵巣で生合成されることが知られています。最近では、生殖細胞系列幹細胞（GSCs）の数が12を刺激交配に応じて、エクジステロイドとのセックスペプチドのシグナル伝達に影響されることを報告しています。
よく注釈付きゲノム情報を含むキイロショウジョウバエ遺伝学および細胞生物学の強力なツール、バイナリ遺伝子発現系、およびトランスジェニックのRNAi技術は、PGおよび卵巣13、14、15で生合成をエクジステロイドために不可欠な遺伝子を同定するために私たちを有効にしています。 ecdysteroidogenic遺伝子が同定されたら、これらの遺伝子の転写調節および遺伝子産物の動的局在は、生合成経路16で検査することができます。この目的のために、定量的逆転写PCR、in situハイブリダイゼーション RNA、及び免疫組織学的分析が行われます。これらの技術の適用は、困難なタスクを含みます。 PGまたは卵巣の精巧な解剖。 1は、果物のサンプリングのために解剖を飛ぶの重要なスキルを練習する必要があるので、特に、ショウジョウバエのPGは、他の昆虫（ 例えばカイコとクロバエ）に比べて相対的に小さいです。さらに、両方のecdysteroidogenic器官は神経支配を受けます中枢神経系（CNS）17、18、19、20秒から。したがって、正確な解剖学的な分析のために、ecdysteroidogenic器官は彼らの神経接続を破壊しない、CNSおよび他の器官と一緒にそのまま保持されなければなりません。
ここでは、Dにおけるステロイド産生器官の解剖と可視化のためのプロトコルを提供します。 ショウジョウバエ。解剖の技術を学ぶことはこれらの実験のための重要な出発点です。また、1が正常にいくつかの抗体とGAL4ドライバーラインとステロイド産生臓器並びにそれらのインタラクティブな器官にラベルを付けることができます。これらの技術、材料、および遺伝学を利用して、一つはステロイドホルモンの生合成の総合的なメカニズムを研究することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちは、エクジステロイド生合成およびキイロショウジョウバエにおけるその調節機構を研究し、そして解剖および免疫染色のためのプロトコルを考案しました。エクジステロイド生合成のタイミングは、ニューロンの入力33を介して、環境手がかりに影響されるので、解剖時の脳、VNC、および他の組織と一緒にecdysteroidogenic器官の神経支配を維持するために…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、この作品のために彼らの技術支援のため玲子喜瀬とTomotsune Amekuに感謝します。我々はまた圭伊藤、オルガ・アレックシーエンコ、明子琴、正幸三浦、ブルーミントンショウジョウバエストックセンター、京都ストックセンター（DGRC）、および株式および試薬のための発達研究ハイブリドーマバンクに感謝しています。この作品は、日本学術振興会科研費助成金番号16K20945、内藤財団、井上科学研究賞からYSNへの助成金によってサポートされていました。文部科学省科研費助成金番号16H04792からRNへの助成金によって。
Materials
| egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
| collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
| yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
| 100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
| rearing larvae | |||
| small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
| standard fly food | the recepi us on the website of Blooington stock center. | ||
| dissection | |||
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
| tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
| Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
| Terumo syringe, 1ml | TERUMO | SS-01T | |
| forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
| insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
| micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| fixation | |||
| ultrapure water | Merck Millipore | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| primary antibody | |||
| anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
| anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| secondary antibody | |||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
| Mounting reagents | |||
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
| imaging | |||
| LSM700 laser scanning microscope system | Carl Zeiss | inverted Axio Observer. Z1 SP left | |
| image processing | |||
| LSM700 ZEN | Carl Zeiss | It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system | |
| ImageJ | |||
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
Referências
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