Beskrevet her er en iscenesatt, atferds screening tilnærming som kan brukes til å skjerme for forbindelser som viser in vivo effekt på kognitive og funksjonelle motoriske oppføringer i transgene musemodeller av β-amyloidose og tauopati. Disse metodene er optimalisert for å skjerme forbindelser for aktivitet i korttids- og arbeidsminneoppgaver.
Her beskriver vi en iscenesatt, atferdsprøve-tilnærming som kan brukes til å skjerme for forbindelser som viser in vivo- effekt på kognitiv og funksjonell motorisk adferd i transgene musemodeller av β-amyloidose og tauopati. Paradigmet inkluderer tester for spontan veksling i en Y-labyrint, en ny gjenstandsgenkjenning og lemmer. Disse testene ble valgt fordi de: 1) forhør funksjon av kognitive eller motoriske domener og korrelere nevrale kretser som er relevante for den humane sykdomsstaten, 2) har klart definerte endepunkter, 3) har lett implementerbare kvalitetskontrollkontroller, 4) kan kjøre inn Et moderat gjennomføringsformat, og 5) krever liten intervensjon av etterforskeren. Disse metodene er utviklet for etterforskere som ønsker å skjerme forbindelser for aktivitet i kortsiktige og arbeidsminnesoppgaver, eller funksjonell motorisk adferd assosiert med Alzheimers sykdom musemodeller. Metodene beskrevet her bruker oppførselstest som engAlder en rekke forskjellige hjerneområder, inkludert hippocampus og ulike kortikale områder. Undersøkere som ønsker kognitive tester som spesifikt vurderer kognisjon formidlet av en enkelt hjernegruppe, kan bruke disse teknikkene til å supplere andre atferdstest.
Alzheimers sykdom (AD) er en progressiv neurodegenerativ lidelse som resulterer i svekkende kognitiv tilbakegang som rammer rundt 44 millioner mennesker over hele verden. For tiden er det ingen tilgjengelige behandlinger for AD som er sykdomsmodifiserende, understreker det presserende behovet for preklinisk oppdagelse av nye terapeutiske strategier for denne sykdommen. Det er opprettet en rekke forskjellige transgene musemodeller som rekapitulerer ulike aspekter av AD 1 , 2 , inkludert mangler i kognitive domener forstyrret hos pasienter 3 . Disse musemodellene er et nyttig verktøy for å lette effektiv screening in vivo .
Når man vurderer en forbindelse for potensiell in vivo- effekt, må en iscenesatt tilnærming tas som skjermer for effektivitet i passende kognitive domener og overvåker også atferd som kan påvirke de spesifikke endepunktene som brukes til åSsesskognisjon. Mange transgene musemodeller av AD utviser hyperaktivitet og andre atferd som kan forstyrre en bestemt kognitiv test, og forby bruk av stoffet i narkotika-screening 4 . Videre, for en tilnærming som skal implementeres i et narkotika-screeningsmiljø, bør de spesielle testene opprettholde minst en moderat gjennomstrømning, ha klart definerte endepunkter, og en prosedyre som krever minimal intervensjon av etterforskerne. Ved bruk av disse kriteriene kan adferdsesskjermer implementeres som viser reproduksjonsevnen, lav intra- og interanalysevarians og effektstørrelser som trengs for sammensatt screening. Detaljert her er metodene vi har ansatt for å skjerme for forbindelser som er effektive for å dempe de kognitive og motoriske fenotyper som er tilstede i transgene musemodeller av β-amyloidose og tauopati 5 , 6 . Metodene som er beskrevet er tilpasset fra vanlige adferds paradigmer rapportert i lIteratur 7 , med spesifikke optimaliseringer og kvalitetskontroll sjekker slik at de kan brukes i transgene musemodeller som er relevante for AD. Denne protokollen kan brukes med en rekke datainnsamlings- og analysesystemer, og antar at etterforskeren har arbeidskunnskap om den tilknyttede programvaren.
Betydningen av teknikken med hensyn til eksisterende metoder
Denne prosedyren er utformet for å skjerme for in vivo aktivitet av forbindelser i transgene musemodeller av p-amyloidose og tauopati. Den benyttede tilnærmingen som brukes her sikrer påvisning av effektive forbindelser i kognitive domener som er relevante for AD 3 . Videre bruker tilnærmingen som er beskrevet her, adferdstest som har klart definerte endepunkter, enkle implementerbare kontroller for kvalitetskontroll, kan kjøre i et moderat gjennomføringsformat, og krever lite intervensjon fra etterforskeren. Disse egenskapene resulterer i analyser som viser god reproduserbarhet innen dyr og på tvers av kohorter, noe som resulterer i lav intra- og interanalysevarians og effektstørrelser (2 ≤ f ≤6) som er robuste nok til å understøtte atferdsmessig profilering i et stofffunnsmiljø.
Kritiske trinn i Protocol
Mange musemodeller som brukes til AD-stoffoppdagelse, viser atferd i samsvar med økt angst og aggresjon. Dette gjør håndteringsevnen viktig for å utføre noen av de adferdstestene som er beskrevet her. Ettersom disse testene er avhengige av umotivert atferd, kan en grov håndtering av etterforskeren på grunn av en hyperaktiv og engstelig eller aggressiv mus betydelig påvirke ytelsen. Høyere angst kan resultere i manglende utførelse av oppgaven, og redusere testens samlede styrke. Videre er lysnivåer i arenaen avgjørende for å lette den spontane bevegelsen som trengs for hver test. Lys lys har en tendens til å øke angst og undertrykke lokomotiv hos gnagere, derfor bør det tas hensyn til å justere omgivende lysnivåer til 30-35 lux i arenaen.
Et annet kritisk aspekt ved prosedyren er å minimere sterke miljøveiledninger som ville forstyrre et dyrs evne til å utføre oppgavene. Rengjøring avArena og gjenstander i mellom løp er viktig fordi mus er tiltrukket av nye dufter i miljøet. Manglende grundig rengjøring av arenaen og gjenstander kan føre til spontan spontan aktivitet og maskering av sann kognitiv ytelse. Undersøkere bør også minimere bruken av personlige hygieneprodukter og colognes / parfymer når de utfører disse prosedyrene. Til slutt viser gnagere robuste daglige og sirkadiske endringer i mange åpen oppførsel 20 inkludert læring og minne 21 . Derfor, for å minimere variansen på grunn av daglige rytmer i basal atferd og kognitiv ytelse, bør alle tester gjøres samtidig på tvers av kohorter og studier.
Videre, spesielt med hensyn til ny gjenstandsgenkjenning, er forsinkelsesintervallet mellom prøve og testfase og valg og plassering av objekter i miljøet kritiske parametere. Minne eksisterer i 3 forskjellige former: korttidsmemOry (STM), mellomtidsminne (ITM) og langtidshukommelse (LTM) 22 , 23 . Endring av intervallet mellom prøve og testfaser fra minutter (STM) til timer (ITM) eller dager (LTM) vil endre typen minne som ble testet ved prosedyre 12 . Dessuten, før du kjører den nye objektgenkjenningsprøven, bør mange gjenstander screenes i en testkonsort av mus for potensielle forstyrrelser ved leting. Et objekt som er overdrevent attraktivt eller avstøtende mot testkohorten, kan ikke brukes når man vurderer ny gjenstandsgenkjenning. Ideelt sett vil alle objekter som skal brukes i testen, når de plasseres i en arena, fremkalle like letetider fra en naiv kohort av mus. Utilstrekkelig testing og optimalisering av objekter kan redusere kraften til ny gjenstandsgenkjenning.
Modifikasjoner og feilsøking
Det er flere faktorer som kan økeTilsynelatende variabilitet i de kognitive tester som er beskrevet her. Mange musemodeller av AD viser hyperdynamisk lokomotiv 3 som kan maske eller endre atferd målt som det kognitive endepunktet. Videre er det voksende bevis på at kjønn 24 , 25 , 26 og til og med moral genotype 27 kan påvirke utvikling og progresjon av nevropatologi og kognitive fenotyper i AD musemodeller. Uventet variabilitet eller manglende implementering av en atferdsoppgave kan skyldes noen av disse faktorene. Ved første gjennomføring av en bestemt adferdstest bør resultatene alltid stratifiseres etter kjønn, alder og, hvis aktuelt, mors genotype. Videre bør kvalitetskontrollene som er skissert i denne prosedyren alltid utføres for å sikre at hyperaktivitet eller annen stereotypad adferd ikke forstyrrer kvantifisering av kognitive endpoints.
envIronment kan også påvirke spontane utforskende oppførsel av gnagere. Dufter eller lyder som ikke kan oppdages for forskere, kan tiltrekke seg eller avstøte mus, skevende resultater av kognitive tester som stole på spontan oppførsel. Når det i utgangspunktet etableres Y-labyrint eller ny gjenstandsgenkjenning, er det viktig å utføre kontrolltiltakene for å sikre at det ikke er noen posisjonsforstyrrelser ved leting av objekter og / eller miljøet. Hvis det oppstår posisjonsforstyrrelser, må utredere grundig undersøke miljøet og potensielt justere belysning, arenaplassering, plassering av testrom i forhold til andre rom i anlegget ( dvs. ikke nær et høyt trafikkområde eller tungt utstyr) og arenarensingsprosedyrer.
Hilsen til testmiljøet er nøkkelen til å oppnå optimal ytelse i den nye gjenstandsgenkjenningsprøven. For eksempel kan lave totale letetider skyldes utilstrekkelig bruk. Som et alternativ til proc procUtgaver som er skissert her for håndtering (Seksjon 2) og arena (punkt 4.2), tilpasning til håndtering og testmiljøet kan utføres som 3, 5 min økter per dag i 2 påfølgende dager.
Begrensninger av teknikken
Som med hvilken som helst prosedyre, har disse atferdstestene begrensninger. Disse prosedyrene har blitt brukt fordi de tester funksjon av forskjellige kortikale regioner og hippocampus. Hvis musemodellen ikke viser funksjonsfeil i hjernegrupper probed av disse testene, vil disse teknikkene ikke være nyttige. Videre har vi valgt kognitive tester som sondrer korttidsminne. Hvis virkningsmekanismen for forbindelsen under preklinisk vurdering ikke forventes å påvirke korttidshukommelsen, bør disse prosedyrene modifiseres tilsvarende ( dvs. øke prøve-testfaseintervallet for å teste langtidshukommelse). Til slutt bruker disse testene umotivert atferd. Derfor, hvis en musemodell er excesSively hyperaktiv eller viser andre stereotype atferd som forhindrer leting av miljøet, kan disse prosedyrene ikke være optimal. Som et alternativ kan man bruke fryktkondisjonering for Tg2576 eller andre β-amyloidosis-musemodeller, eller den romlige vannet labyrinten for rTg4510 eller andre musemodeller av tauopati 3 .
Fremtidige applikasjoner
Når disse prosedyrene har blitt vellykket vedtatt i laboratoriet, kan flere modifikasjoner eller utvidelser gjøres for å vurdere ytterligere kognitive og funksjonelle motoriske tiltak. For eksempel, endre den nye objektgenkjenningsoppgaven for å bestemme om en mus kan gjenkjenne en endring i plassering av et objekt 13 . Alternativt, i stedet for å bruke objekter, kan man bruke andre mus og gjennomføre en test av sosial anerkjennelse. Med hensyn til lemmer og motorfunksjon, kan man supplere den testen med ledningshenger og / eller grepfasthetsprøver. TesterDetaljert i denne metoden danner en fast base for å skjerme for forbindelser som har in vivo- effekt i translasjonelle musemodeller for AD og kan tilpasses eller modifiseres på mange måter for best å forhøre en bestemt musemodell eller møte behovene til et unikt legemiddeloppdagelsesprogram .
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne har ingen bekreftelser.
Topscan Lite-High Throughput | Cleversys | Automated behavioral analysis. Includes cameras and video acquisition system, laptop. | |
ObjectScan | Cleversys | Software module for accurate object exploration quantification | |
Open field for mouse | Cleversys | CSI-OF-M | Arena for novel object recognition |
Y-maze for mouse | Custom | Arms: 30cm long, 10 cm wide, 20cm high walls, placed 120deg apart. | |
Camera mount for open field | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. Two mounts, each covers two boxes. |
Camera mount for Y-maze | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. One mount covers two mazes. |
Marbles | Inperial Toy | 8565 | Standard (15.5mm Dia) glass marbles. |
Dice | Cardinal Industries | 770 | Standard (0.650 inch) white dice with black dots. |
LOCTITE Fun-Tak | Henkel | B018A3AG0W | Standard blue sticky tak |
EtOH | Nexeo Solutions | 82452 | 100% Ethanol Diluted to 70% using distilled Water |
dH2O | Tulpenhocken Spring Water Co. | – | PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320 |
Paper towels | Procter & Gamble | B019DM86LA | Bounty, White |
Handheld video camera | Apple, Inc. | MKV92LL/A | Acquisition of Limb clasping video, Iphone 6S Plus (or functional equivalent). |
Gloves | SafePOINT, L.L.C. | GL640-2 | Standard, Powder free Latex Gloves, Medium |
Light meter | Dr. Meter | LX1330B | Lighting @ the bottom of Open Field= 35 LUX, Lighting @ bottom of Y-Maze= 32 LUX |
Bleach germicidal wipes | Clorox | Sterilization of equipment during & after use |