كابريسي: الجمعية الكيميرا بواسطة الانتعاش البلازميد والقيود إنزيم إدراج الموقع
Summary
هنا، نقدم التجمع الكيميرا عن طريق الانتعاش البلازميد وتقييد انزيم موقع الإدراج (كابريسي)، وهو بروتوكول على أساس إدراج مواقع انزيم تقييد في تسلسل الحمض النووي مرادف والانتعاش البلازميد وظيفية. هذا البروتوكول هو طريقة سريعة ومنخفضة التكلفة لدمج جينات الترميز البروتين.
Abstract
هنا، نقدم التجمع الكيميرا عن طريق الانتعاش البلازميد وتقييد انزيم موقع الإدراج (كابريسي). كابريسي يستفيد من العديد من نقاط القوة في طريقة الانتعاش البلازميد الأصلي ويدخل الهضم انزيم تقييد لتخفيف ردود الفعل ربط الحمض النووي (مطلوب لجمع الكيميرا). لهذا البروتوكول، المستخدمين استنساخ الجينات ويلديب في نفس البلازميد (pUC18 أو pUC19). بعد اختيار السيليكو لمناطق تسلسل الأحماض الأمينية حيث يجب تجميع الشمرات، يحصل المستخدمون على جميع تسلسل الحمض النووي المترادف الذي يشفر لهم. النصوص البرمجية بيرل مخصصة تمكن المستخدمين من تحديد جميع تسلسل الحمض النووي مرادف. بعد هذه الخطوة، يبحث النصي بيرل آخر لمواقع انزيم تقييد على جميع تسلسل الحمض النووي مرادف. يتم إجراء هذا التحليل السيليكو أيضا باستخدام الجينات المقاومة الأمبيسلين ( أمبر ) وجدت على البلازميدات pUC18 / 19. المستخدمين تصميم أوليغونوكلأوتيدس داخل المناطق المرادف لتعطيل ويلديب و أمبر الجينات عن طريق ير. بعد أوبتإينينغ وتنقية شظايا الحمض النووي التكميلية، ويتم إنجاز انزيم تقييد الهضم. يتم تحقيق تجمع الكيميرا من خلال ليغاتينغ شظايا الحمض النووي التكميلية المناسبة. يتم اختيار ناقلات pUC18 / 19 من أجل كابريسي لأنها توفر مزايا تقنية، مثل الحجم الصغير (2،686 زوجا أساسيا)، ورقم نسخة عالية، وميزات تفاعل تسلسل مفيدة، وتوافر تجاري. إن استخدام إنزيمات التقييد لتجمع الكيميرا يلغي الحاجة إلى بوليمرات الحمض النووي التي تنتج منتجات غير حادة. كابريسي هو طريقة سريعة ومنخفضة التكلفة لدمج جينات الترميز البروتين.
Introduction
وقد تم استخدام تجميع الجينات الخيميري على نطاق واسع في البيولوجيا الجزيئية لتوضيح وظيفة البروتين و / أو لأغراض التكنولوجيا الحيوية. هناك أساليب مختلفة لتفجير الجينات، مثل تداخل ير التضخيم المنتج 1 ، الانتعاش البلازميد 2 ، إعادة التركيب مثلي 3 ، أنظمة كريسبر-Cas9 4 ، إعادة توجيه الموقع الموجهة 5 ، وتجميع جيبسون 6 . كل من هذه المزايا التقنية المختلفة؛ على سبيل المثال، ومرونة تداخل تصميم ير، واختيار الجسم الحي من الإنشاءات خلال الانتعاش البلازميد، أو كفاءة عالية من كريسبر-Cas9 ونظم جيبسون. من ناحية أخرى، يمكن أن تنشأ بعض الصعوبات أثناء أداء بعض هذه الأساليب. على سبيل المثال، يعتمد النهجان الأولان على شظايا الحمض النووي غير الحادة، وقد يكون ربط هذه الأنواع من المنتجات تحديا تقنيا مقارنة بالأشكال الساكنةكي-إندد ربط. يمكن إعادة التركيب الموجه للموقع ترك آثار تسلسل الحمض النووي اضافية (ندوب) على الأصل، كما هو الحال في نظام كريلكسب 5 . يمكن كريسبر-Cas9 تعديل المناطق الجينوم أخرى في بعض الأحيان بالإضافة إلى الموقع المستهدف 4 .
هنا، نحن نقدم تجميع الكيميرا عن طريق الانتعاش البلازميد وتقييد الإدراج انزيم الموقع (كابريسي)، وهو بروتوكول لدمج جينات الترميز البروتين الذي يجمع بين طريقة الانتعاش البلازميد (برم) مع إدراج مواقع انزيم تقييد على تسلسل الحمض النووي مرادف، وتعزيز كفاءة ربط . لضمان سلامة تسلسل الأحماض الأمينية، يتم إدراج مواقع انزيم تقييد على امتداد تسلسل الحمض النووي مرادف. من بين فوائد كابريسي أنه يمكن أن يؤديها باستخدام الكواشف المخبرية العادية / أدوات (على سبيل المثال ، الإنزيمات، والخلايا المختصة، والحلول، و ثيرمويكلر) وأنه يمكن أن تعطي نتائج سريعة (عندما يتم استخدام الإنزيمات المناسبة). الاعتماد على التقييدإنزيم المواقع التي تخرج من تسلسل الحمض النووي مرادف يمكن أن تحد من اختيار نقاط الاندماج الدقيق داخل البروتينات ذات الاهتمام. في مثل هذه الحالات، يجب أن تنصهر الجينات المستهدفة باستخدام أوليغونوكليوتيدس متداخلة، وينبغي إدراج مواقع انزيم تقييد على الجينات المقاومة للناقل.
كابريسي يتكون من سبع خطوات بسيطة ( الشكل 1 ): 1) اختيار ناقلات الاستنساخ، pUC18 أو pUC19 6 ؛ 2) في تحليل سيليكو من تسلسل ويلديب أن تنصهر. 3) اختيار المناطق كسر لتجمع الكيميرا وانزعاج البلازميد. 4) في توليد السيليكو من تسلسل الحمض النووي مرادف التي تحتوي على مواقع انزيم تقييد؛ 5) استنساخ مستقل للجينات ويلديب في البلازميد المحدد. 6) اضطراب البلازميد عن طريق ير، تليها تقييد انزيم الهضم. و 7) الانتعاش البلازميد باستخدام ربط الحمض النووي والتحول البكتيري. وينبغي التحقق من الجينات الخيميائية التي تنتجها هذه التقنية ثإيث التسلسل.
وتوفر ناقلات pUC18 / 19 مزايا تقنية للاستنساخ وجمع الكيميرا، مثل الحجم الصغير ( أي 2،686 زوجا أساسيا)، ورقم نسخة عالية، وميزات تفاعل تسلسل مفيدة، وتوافر تجاري 7 . هنا، تم استخدام مضيف إشيريشيا كولي لتجميع ومعالجة الكيميرا لأن الثقافات البكتيرية رخيصة وتنمو بسرعة. وبالنظر إلى هذا، سوف تكون هناك حاجة لاستنساخ لاحق من شظايا الانصهار في البلازميدات الهدف النهائي (على سبيل المثال، ناقلات التعبير كما PRK415 في البكتيريا أو بمف في خلايا الثدييات).
تم اختبار كابريسي لدمج اثنين من الجينات عامل سيغما الأولية: E. كوليربود و ريزوبيوم إتليسيغا . عوامل سيغما الأولية هي وحدات بوليميراز الحمض النووي الريبي المسؤولة عن بدء النسخ، وتتكون من أربعة مجالات ( أي σ1، σ2، σ3، σ4) 8 . تسلسل الأحماض الأمينية لينغتساعة من البروتينات المشفرة بواسطة ربود و سيغا هي 613 و 685، على التوالي. ربد و سيغا حصة 48٪ الهوية (98٪ التغطية). تم تقسيم هذه العوامل سيجما الأولية إلى شظيتين تكميلية بين المناطق σ2 و σ3. تم تجميع اثنين من الجينات الخيميائية وفقا لهذا التصميم: الكيميرا 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) و تشيميرا 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). تم التحقق من منتجات الحمض النووي الانصهار عن طريق التسلسل.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تصميم كابريسي كبديل ل برم 2 . و برم الأصلي هو تقنية قوية. فإنه يسمح لانصهار تسلسل الحمض النووي على طول أي جزء من الجينات المختارة. ل برم، الجينات ويلديب يجب استنساخ في نفس البلازميد. بعد ذلك، تم تصميم أوليغونوكلأوتيدس داخل ويلديب والجينات المقاومة للمض?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد حظي هذا العمل بدعم من المجلس الوطني للثقافة والتراث والمكسيك (المنحة رقم 154833) والجامعة الوطنية المستقلة للمكسيك. ويود المؤلفون أن يشكروا فيكتور غونزاليس، وروزا I. سانتاماريا، وباتريشيا بوستوس، وسوليداد خواريز على مشورتهم الإدارية والتقنية.
Materials
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304011 | Produces a mix of blunt/3’-A overhang ended PCR products |
| High pure plasmid isolation kit | Roche | 11754785001 | Used for all plasmid purification reactions |
| High pure PCR product purification kit | Roche | 11732676001 | Used for all PCR purification reactions from agarose gels |
| AflII restriction enzyme | New England Biolabs | R0520L | Recognizes sequence 5’-CTTAAG-3’ and cuts at 37 °C |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3142L | Recognizes sequence 5’-GGTACC-3’ and cuts at 37 °C |
| SpeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3133L | Recognizes sequence 5’-ACTAGT-3’ and cuts at 37 °C |
| XbaI restriction enzyme | New England Biolabs | R0145L | Recognizes sequence 5’-TCTAGA-3’ and cuts at 37 °C |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A0166-5G | Antibiotics |
| Nalidixic acid | Sigma Aldrich | N8878-5G | Antibiotics |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625-1KG | Bacterial cell culture |
| Casein peptone | Sigma Aldrich | 70171-500G | Bacterial cell culture |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | Sodium chloride |
| Agar | Sigma Aldrich | 05040-1KG | Bacterial cell culture |
| XbaI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0684 | Fast digest XbaI enzyme |
| KpnI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0524 | Fast digest KpnI enzyme |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Fast DNA ligation kit |
| AflII restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0834 | Fast digest AflII enzyme |
| SpeI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD1253 | Fast digest SpeI enzyme |
Referências
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Vos, M. J., Kampinga, H. H. A PCR amplification strategy for unrestricted generation of chimeric genes. Anal. Biochem. 380 (2), 338-340 (2008).
- Hawkins, N. C., Garriga, G., Beh, C. T. Creating Precise GFP Fusions in Plasmids Using Yeast Homologous Recombination. Biotechniques. 34 (1), 1-5 (2003).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
- Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Norrander, J., Kempe, T., Messing, J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene. 26 (1), 101-106 (1983).
- Gruber, T. M., Gross, C. A. Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space. Annu Rev Microbiol. 57, 441-466 (2003).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX. Curr Protoc Bioinformatics. , 1-22 (2002).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. CSHLP. , (2001).
- Rutherford, K., et al. Artemis: sequence visualization and annotation. Bioinformatics. 16 (10), 944-945 (2000).
