CAPRRESI: сбор химеры путем вставки плазмиды и рестрикционной ферментации сайта
Summary
Здесь мы представляем сбор химеры путем восстановления плазмиды и введения сайта рестрикционного фермента (CAPRRESI), протокола, основанного на введении сайтов рестрикционных ферментов в последовательности последовательностей синонимов и восстановления функциональной плазмиды. Этот протокол является быстрым и недорогим методом слияния белок-кодирующих генов.
Abstract
Здесь мы представляем сбор химеры путем восстановления плазмиды и введения сайта рестрикционного фермента (CAPRRESI). CAPRRESI извлекает выгоду из многих преимуществ исходного метода извлечения плазмиды и вводит переваривание рестрикционного фермента, чтобы облегчить реакции лигирования ДНК (необходимые для сборки химеры). Для этого протокола пользователи клонируют гены дикого типа в одну и ту же плазмиду (pUC18 или pUC19). После выбора силикона областей аминокислотной последовательности, в которых собираются химеры, пользователи получают все последовательности синонимов ДНК, которые их кодируют. Ad hoc Perl-скрипты позволяют пользователям определять все последовательности синонимов ДНК. После этого шага другой скрипт Perl ищет сайты рестрикционных ферментов на всех синонимичных последовательностях ДНК. Это в силиконовом анализе также выполняется с использованием гена устойчивости к ампициллину ( ampR ), обнаруженного на плазмидах pUC18 / 19. Пользователи разрабатывают олигонуклеотиды внутри регионов синонима, чтобы разрушить гены дикого типа и ampR с помощью ПЦР. После obtАфинирующих и очищающих комплементарных фрагментов ДНК, происходит переваривание рестрикционного фермента. Сбор химеры достигается путем лигирования соответствующих комплементарных фрагментов ДНК. Векторы pUC18 / 19 выбраны для CAPRRESI, поскольку они предлагают технические преимущества, такие как малый размер (2686 базовых пар), высокий номер копии, преимущества функции реакции последовательности и коммерческая доступность. Использование рестрикционных ферментов для сборки химеры устраняет необходимость в ДНК-полимеразах, дающих продукты с тупыми концами. CAPRRESI – это быстрый и недорогой метод слияния белок-кодирующих генов.
Introduction
Сбор химерных генов широко используется в молекулярной биологии для выяснения функции белка и / или для биотехнологических целей. Существуют различные способы слияния генов, такие как перекрытие амплификации ПЦР-продукта 1 , восстановление плазмиды 2 , гомологичная рекомбинация 3 , системы CRISPR-Cas9 4 , сайт-направленная рекомбинация 5 и сборка 6 Гибсона. Каждый из них предлагает различные технические преимущества; Например, гибкость перекрывающегося проектирования ПЦР, выбор конструкций конструкций во время восстановления плазмиды in vivo или высокая эффективность систем CRISPR-Cas9 и Gibson. С другой стороны, некоторые трудности могут возникать при выполнении некоторых из этих методов; Например, первые два подхода основываются на фрагментах ДНК с тупым концом, и лигирование этих типов продуктов может быть технически сложным по сравнению со стандартнымиKy-end лигирование. Рекомбинация на сайте может оставлять следы дополнительных ДНК-последовательностей (шрамов) на оригинале, как в системе CreloxoxP 5 . CRISPR-Cas9 может иногда модифицировать другие области генома в дополнение к целевому сайту 4 .
Здесь мы вводим сбор химеры путем извлечения плазмиды и введения сайта рестрикционного фермента (CAPRRESI), протокола для слияния белок-кодирующих генов, который объединяет способ восстановления плазмиды (PRM) с введением сайтов рестрикционных ферментов на синонимичные последовательности ДНК, повышая эффективность лигирования , Для обеспечения целостности аминокислотных последовательностей сайты рестрикционных ферментов вставляются в синонимичные последовательности ДНК. Среди преимуществ CAPPRESI заключается в том, что он может быть выполнен с использованием обычных лабораторных реагентов / инструментов ( например , ферментов, компетентных клеток, растворов и термоциклеров) и что он может давать быстрые результаты (при использовании соответствующих ферментов). Опираясь на ограничениеСайты ферментов, которые появляются из последовательностей ДНК синонимов, могут ограничить выбор точных точек слияния внутри интересующих белков. В таких случаях гены-мишени следует сливать с использованием перекрывающихся олигонуклеотидов, а сайты рестрикционных ферментов следует вставлять в ген устойчивости вектора.
CAPRRESI состоит из семи простых шагов ( рис. 1 ): 1) выбор вектора клонирования pUC18 или pUC19 6 ; 2) в силиконовом анализе последовательностей дикого типа, подлежащих сплавлению; 3) выбор областей разломов для сборки химеры и разрушения плазмиды; 4) в силиконовой генерации синонимичных последовательностей ДНК, содержащих сайты рестрикционных ферментов; 5) независимое клонирование генов дикого типа в выбранную плазмиду; 6) нарушение плазмиды с помощью ПЦР с последующим расщеплением рестрикционным ферментом; И 7) восстановление плазмиды с использованием лигирования ДНК и бактериальной трансформации. Химерные гены, полученные этой методикой, должны быть проверены wС последовательностью.
Векторы pUC18 / 19 предлагают технические преимущества для клонирования и сборки химеры, такие как малые размеры ( то есть, 2686 пар оснований), высокое количество копий, выгодные функции реакции секвенирования и коммерческая доступность 7 . Здесь хозяин Escherichia coli использовался для сборки и обработки химер, потому что бактериальные культуры дешевы и быстро растут. Учитывая это, потребуется последующее клонирование фрагментов слияния в конечные целевые плазмиды ( например, векторы экспрессии в виде pRK415 у бактерий или pCMV в клетках млекопитающих).
CAPRRESI был протестирован на слияние двух первичных генов сигма-фактора: E. colirpoD и Rhizobium etlisigA . Первичные сигма-факторы являются субъединицами РНК-полимеразы, ответственными за инициирование транскрипции, и они состоят из четырех доменов ( т. Е. Σ1, σ2, σ3 и σ4) 8 . Длина аминокислотной последовательностиЧ белков, кодируемых rpoD и sigA, равны соответственно 613 и 685. RpoD и SigA имеют 48% идентичности (охват 98%). Эти первичные сигма-факторы были разделены на два дополнительных фрагмента между областями σ2 и σ3. В соответствии с этой схемой были собраны два химерных гена: химера 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) и химера 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). Продукты слияния ДНК были проверены путем секвенирования.
Protocol
Representative Results
Discussion
CAPRRESI был разработан как альтернатива PRM 2 . Оригинальный PRM – это мощная техника; Он позволяет слияние последовательностей ДНК вдоль любой части выбранных генов. Для PRM гены дикого типа должны быть клонированы в одну и ту же плазмиду. После этого олигонуклеотиды сконструи?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным конгрессом и технологией, КОНАЦИТом, Мексикой (грант № 154833) и Национальной академией штата Мексика. Авторы хотели бы поблагодарить Виктора Гонсалеса, Розу И. Сантамарию, Патрицию Бустос и Соледада Хуареса за их административные и технические консультации.
Materials
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304011 | Produces a mix of blunt/3’-A overhang ended PCR products |
| High pure plasmid isolation kit | Roche | 11754785001 | Used for all plasmid purification reactions |
| High pure PCR product purification kit | Roche | 11732676001 | Used for all PCR purification reactions from agarose gels |
| AflII restriction enzyme | New England Biolabs | R0520L | Recognizes sequence 5’-CTTAAG-3’ and cuts at 37 °C |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3142L | Recognizes sequence 5’-GGTACC-3’ and cuts at 37 °C |
| SpeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3133L | Recognizes sequence 5’-ACTAGT-3’ and cuts at 37 °C |
| XbaI restriction enzyme | New England Biolabs | R0145L | Recognizes sequence 5’-TCTAGA-3’ and cuts at 37 °C |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A0166-5G | Antibiotics |
| Nalidixic acid | Sigma Aldrich | N8878-5G | Antibiotics |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625-1KG | Bacterial cell culture |
| Casein peptone | Sigma Aldrich | 70171-500G | Bacterial cell culture |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | Sodium chloride |
| Agar | Sigma Aldrich | 05040-1KG | Bacterial cell culture |
| XbaI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0684 | Fast digest XbaI enzyme |
| KpnI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0524 | Fast digest KpnI enzyme |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Fast DNA ligation kit |
| AflII restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0834 | Fast digest AflII enzyme |
| SpeI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD1253 | Fast digest SpeI enzyme |
Referências
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Vos, M. J., Kampinga, H. H. A PCR amplification strategy for unrestricted generation of chimeric genes. Anal. Biochem. 380 (2), 338-340 (2008).
- Hawkins, N. C., Garriga, G., Beh, C. T. Creating Precise GFP Fusions in Plasmids Using Yeast Homologous Recombination. Biotechniques. 34 (1), 1-5 (2003).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
- Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Norrander, J., Kempe, T., Messing, J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene. 26 (1), 101-106 (1983).
- Gruber, T. M., Gross, C. A. Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space. Annu Rev Microbiol. 57, 441-466 (2003).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX. Curr Protoc Bioinformatics. , 1-22 (2002).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. CSHLP. , (2001).
- Rutherford, K., et al. Artemis: sequence visualization and annotation. Bioinformatics. 16 (10), 944-945 (2000).
