Optimering og sammenligningsanalyse af planteorganell DNA-berigelsesmetoder egnet til næste generations sekventering
Summary
Sammenligningen og optimeringen af to planteorganelle DNA-berigelsesmetoder er præsenteret: traditionel differentiel centrifugering og fraktionering af det totale gDNA baseret på methyleringsstatus. Vi vurderer den resulterende DNA-mængde og kvalitet, demonstrerer ydeevne ved kortlæsning af næste generations sekventering og diskuterer potentialet til brug i langlæsende enkeltmolekylære sekventering.
Abstract
Plantorganelle genomer indeholder store, gentagne elementer, der kan undergå parring eller rekombination for at danne komplekse strukturer og / eller sub-genomiske fragmenter. Organellærgener findes også i blandinger inden for en given celle eller vævstype (heteroplasmien), og en overflod af subtyper kan ændre sig under udvikling eller under stress (substøkiometrisk forskydning). Next generation sekvensering (NGS) teknologier er nødvendige for at opnå en dybere forståelse af organellar genom struktur og funktion. Traditionelle sekventeringsundersøgelser anvender adskillige metoder til opnåelse af organellært DNA: (1) Hvis en stor mængde startvæv anvendes, homogeniseres den og underkastes differentiel centrifugering og / eller gradientrensning. (2) Hvis der anvendes en mindre mængde væv ( dvs. hvis frø, materiale eller rum er begrænset), udføres samme fremgangsmåde som i (1) efterfulgt af hel-genom-amplifikation for at opnå tilstrækkeligt DNA. (3) Bioinformatikanalyse kan bruges til at seqUence det totale genomiske DNA og at analysere organellar læser. Alle disse metoder har iboende udfordringer og kompromiser. I (1) kan det være vanskeligt at opnå en sådan stor mængde startvæv; I (2) kunne helgenomdannelse indføre en sekvenseringsforspænding; Og i (3) kunne homologi mellem nukleare og organelle genomer interferere med samling og analyse. I planter med store atomgener er det fordelagtigt at berige for organellært DNA for at reducere sekventeringsomkostninger og sekvenskompleksitet til bioinformatikanalyser. Her sammenligner vi en traditionel differenscentrifugeringsmetode med en fjerde metode, en tilpasset CpG-methyl pulldown-tilgang, for at adskille det totale genomiske DNA i nukleare og organelle fraktioner. Begge metoder giver tilstrækkeligt DNA til NGS, DNA, der er stærkt beriget for organellære sekvenser, omend i forskellige forhold i mitokondrier og chloroplaster. Vi præsenterer optimeringen af disse metoder til hvedebladevæv og diskuterer store fordele og dUlemper ved hver tilgang i forbindelse med prøveindgang, protokollethed og downstream-applikation.
Introduction
Genomsekvensering er et kraftfuldt værktøj til at dissekere det underliggende genetiske grundlag for vigtige planteegenskaber. De fleste genom-sekventeringsundersøgelser fokuserer på det nukleære genomindhold, da størstedelen af gener er placeret i kernen. Organellære genomer, herunder mitokondrierne (på tværs af eukaryoter) og plastider (i planter, den specialiserede form, chloroplasten, arbejder i fotosyntese) bidrager imidlertid til væsentlig genetisk information, der er afgørende for organisationsudvikling, stressrespons og overordnet fitness 1 . Organellærgener er typisk inkluderet i totale DNA-ekstraktioner beregnet til nuklear genom sekventering, selv om metoder til reduktion af organelle tal før DNA-ekstraktion også anvendes 2 . Mange undersøgelser har anvendt sekvenseringsresultater fra totale gDNA-ekstraktioner til at samle organellære genomer 3 , 4 , 5 ,Xref "> 6 , 7. Men når målet for undersøgelsen er at fokusere på organellære genomer, øges sekventeringsomkostningerne, fordi mange læsninger er" tabte "til de nukleare DNA-sekvenser, især i planter med store nukleare genomer På grund af overlapningen og overførslen af organellære sekvenser i det nukleare genom og mellem organeller, er det desuden en af opkøling af den korrekte kortlægningsposition for sekventering, der læser det korrekte genom, bioinformatisk udfordrende 2 , 8. Rensningen af organellære genomer fra det nukleære genom er en Strategi for at reducere disse problemer. Yderligere bioinformatik strategier kan bruges til at adskille læser det kort til regioner af homologi mellem mitokondrier og chloroplaster.
Mens organellærgenerne fra mange plantearter er blevet sekventeret, er der ikke meget kendt om bredden af organellær genom diversitetTilgængelig i vilde populationer eller i dyrkede avlspuljer. Organellære genomer er også kendt for at være dynamiske molekyler, der undergår væsentlig strukturel omlægning på grund af rekombination mellem gentagelsessekvenser 9 . Desuden er flere kopier af organellargenomet indeholdt i hver organel, og flere organeller er indeholdt i hver celle. Ikke alle kopier af disse genomer er identiske, som er kendt som heteroplasmisk. I modsætning til det kanoniske billede af "mastercirkler" er der nu voksende beviser for et mere komplekst billede af organellære genomstrukturer, herunder sub-genomiske cirkler, lineære kromosomer, lineære concatamere og forgrenede strukturer 10 . Samlingen af planteorganelle genomer kompliceres yderligere af deres forholdsvis store størrelser og væsentlige inverterede og direkte gentagelser.
Traditionelle protokoller til organellær isolering, DNA rensning og efterfølgende genom E-sekventering er ofte besværlig og kræver store mængder vævsindgang, med flere gram op til hundrede gram ungt bladvæv, der er nødvendigt som udgangspunkt 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Dette gør organellærgenomsekvensering utilgængelig, når væv er begrænset. I nogle situationer er frømængderne begrænsede, såsom når det er nødvendigt at sekvensere på generationsbasis eller i hansterile linjer, der skal opretholdes via krydsning. I disse situationer kan organellært DNA renses og derefter udsættes for hel-genom-amplifikation. Hele-genom-amplifikation kan imidlertid indføre signifikant sekventeringsforspænding, hvilket er et særligt problem ved vurdering af strukturelle variationer, sub-genomiske strukturer og heteroplasmieniveauer> 18. Nylige fremskridt i bibliotekets forberedelse til kortlæsede sekventeringsteknologier har overvundet lavindgangsbarrierer for at undgå hel-genom-amplifikation. For eksempel tillader Illumina Nextera XT-bibliotekets forberedelsessæt så lidt som 1 ng DNA, der skal anvendes som input 19 . Standardbiblioteksforberedelser til langlæsede sekventeringsapplikationer, såsom PacBio eller Oxford Nanopore-sekventeringsteknologier, kræver imidlertid stadig en relativt høj mængde input-DNA, som kan udgøre en udfordring for organellær genom-sekventering. For nylig er der udviklet nye brugerdefinerede, langlæsede sekventeringsprotokoller for at reducere inputmængderne og for at lette genometsekvensering i prøver, hvor opnåelse af mikrogrammængder af DNA er vanskelig 20 , 21 . Imidlertid er opnåelse af højmolekylære, rene organellære fraktioner til føde i disse bibliotekspræparationer fortsat en udfordring.
Vi søgte tO sammenligne og optimere organellære DNA berigelses- og isoleringsmetoder egnede til NGS uden behov for hel-genom-amplifikation. Specifikt var vores mål at bestemme bedste praksis for at berige for organellært DNA med høj molekylvægt fra begrænsede udgangsmaterialer, såsom en subsample af et blad. Dette arbejde præsenterer en komparativ analyse af metoder til at berige for organellært DNA: (1) en modificeret, traditionel differentieringsscentrifugeringsprotokol versus (2) en DNA-fraktioneringsprotokol baseret på anvendelsen af et kommercielt tilgængeligt DNA-CpG-methylbindende domæneprotein-udløbsfremgangsmåde 22 påført plantevæv 23 . Vi anbefaler bedste praksis til isolering af organellært DNA fra hvedebladvæv, som let kan udvides til andre planter og vævstyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Til dato er de fleste organellære sekventeringsundersøgelser centreret om traditionelle DC-metoder til at berige for specifikt DNA. Metoder til isolering af organeller fra forskellige planter er blevet beskrevet, herunder mose 40 ; Monocotter såsom hvede 15 og havre 11 ; Og dicots såsom arabidopsis 11 , solsikke 17 og rapsfrø 14 . De fleste protokoller fokuserer på bladvæ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne anerkende finansiering fra USA's Department of Agriculture-Agricultural Research Service og fra National Science Foundation (IOS 1025881 og IOS 1361554). Vi takker R. Caspers for vedligeholdelse af drivhuse og plantepleje. Vi takker også universitetet i Minnesota Genomics Center, hvor Illumina biblioteket forberedelser og sekventering blev udført. Vi er også taknemmelige for kommentarerne fra tidsskriftets redaktører og fire anonyme korrekturlæsere, der yderligere styrker vores manuskript. Vi takker også OECD for et fællesskab til SK at integrere disse protokoller for samarbejdsprojekter med kolleger i Japan.
Materials
| 2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME) | Sigma Aldrich | M3148-100ml | |
| 2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagent | Sigma Aldrich | I9516 | |
| agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agarose | Bio-Rad | 1613108 | |
| analytical balance | Mettler Toledo | AB54-S | |
| balance | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | B4287-25G | |
| Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8in | SPEX SamplePrep | 2183 | |
| Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 ml tubes | SPEX SamplePrep | 2664 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| ethanol, absolute | Decon Laboratories | 2716 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5M Solution, pH8.0 | Fisher | BP2482-500 | |
| gel imaging system | |||
| gel stain | Such as GelRed or Ethidium Bromide | ||
| grinding pestle, wide tip for 2 ml conical tubes | |||
| Guanidine-HCl, 8M solution | ThermoFisher | 24115 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| liquid nitrogen | |||
| Lysing enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma | L1412 | |
| Magnesium Chloride | G Bioscience | 24115 | |
| magnetic rack | ThermoFisher | A13346 | |
| microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 ml | Eppendorf | 22431021 | |
| microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 ml | Eppendorf | ||
| microcentrifuge, refrigerated | Sorvall | Legend X1R | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 ml tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 ml tubes |
| microcentrifuge, room temperature | Eppendorf | 5424 | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes |
| Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | MRCFOR100 | |
| Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnel | EMD Millipore | 475855 | |
| NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit | New England Biolabs | E2612L | |
| parafilm | Parafilm M | PM992 | |
| plastic pots and trays | |||
| polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher | BP431-100 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III) | Bio-Rad | 1703697 | |
| purification beads, Agencourt AMpureXP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | |
| Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction Kit | Qiagen | 10223 | |
| Qiagen Buffer EB (elution buffer) | Qiagen | 19086 | |
| Qiagen DNA Extraction Buffer Set | Qiagen | 19060 | |
| QiaRack | Qiagen | 19015 | |
| qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480) | Roche | ||
| qPCR plate sealing film | Roche | 4729757001 | |
| qPCR plate, 96 well plate | Roche | 4729692001 | |
| Qubit assay tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit Broad Spectrum assay kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit High Sensitivity assay kit | Life Technologies | Q32851 | |
| RNaseA | Qiagen | 19101 | |
| Serological pipettes (20 ml) and pipet-aid | Fisher | 13-678-11 | |
| Small funnels, 1 per sample | |||
| Sodium Chloride | Ambion | AM9759 | |
| Soft paintbrush, 2 per sample | |||
| SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizer | SPEX SamplePrep | Or another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced. | |
| Sucrose | Omnipure | 8550 | |
| TBE | |||
| thermomixer | |||
| Tris | Sigma | T2819-100ml | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| tube rotater | |||
| tubes, 50 mL conical polypropylene | Corning | 352070 | |
| tubes, 50 ml high-speed polypropylene | ThermoScientific/Nalgene | 3119-0050 | e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent |
| vermiculite | |||
| water bath | |||
| water, sterile and certified Nuclease-free | Fisher | 1481 | |
| water, sterile milliQ |
Referências
- Liberatore, K. L., Dukowic-Schulze, S., Miller, M. E., Chen, C., Kianian, S. F. The role of mitochondria in plant development and stress tolerance. Free Radic Biol Med. 100, 238-256 (2016).
- Samaniego Castruita, J. A., Zepeda Mendoza, M. L., Barnett, R., Wales, N., Gilbert, M. T. Odintifier–A computational method for identifying insertions of organellar origin from modern and ancient high-throughput sequencing data based on haplotype phasing. BMC Bioinformatics. 16 (232), 1-13 (2015).
- Zhang, T., Zhang, X., Hu, S., Yu, J. An efficient procedure for plant organellar genome assembly, based on whole genome data from the 454 GS FLX sequencing platform. Plant Methods. 7 (38), 1-8 (2011).
- Wambugu, P. W., Brozynska, M., Furtado, A., Waters, D. L., Henry, R. J. Relationships of wild and domesticated rices (Oryza AA genome species) based upon whole chloroplast genome sequences. Sci Rep. 5 (13957), 1-9 (2015).
- Iorizzo, M., et al. De novo assembly of the carrot mitochondrial genome using next generation sequencing of whole genomic DNA provides first evidence of DNA transfer into an angiosperm plastid genome. BMC Plant Biol. 12 (61), 1-17 (2012).
- Park, S., et al. Complete sequences of organelle genomes from the medicinal plant Rhazya stricta (Apocynaceae) and contrasting patterns of mitochondrial genome evolution across asterids. BMC Genomics. 15 (405), 1-18 (2014).
- Skippington, E., Barkman, T. J., Rice, D. W., Palmer, J. D. Miniaturized mitogenome of the parasitic plant Viscum scurruloideum is extremely divergent and dynamic and has lost all nad genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (27), E3515-E3524 (2015).
- Wicke, S., Schneeweiss, G. M., Hörandl, E., Appelhans, M. Chapter 1. Next Generation Sequencing in Plant Systematics. , (2015).
- Sloan, D. B. One ring to rule them all? Genome sequencing provides new insights into the ‘master circle’ model of plant mitochondrial DNA structure. New Phytol. 200 (4), 978-985 (2013).
- Woloszynska, M. Heteroplasmy and stoichiometric complexity of plant mitochondrial genomes–though this be madness, yet there’s method in’t. J Exp Bot. 61 (3), 657-671 (2010).
- Ahmed, Z., Fu, Y. B. An improved method with a wider applicability to isolate plant mitochondria for mtDNA extraction. Plant Methods. 11 (56), 1-11 (2015).
- Ejaz, M., et al. Comparison of small scale methods for the rapid and efficient extraction of mitochondrial DNA from wheat crop suitable for down-stream processes. Genet Mol Res. 13 (4), 10320-10331 (2014).
- Eubel, H., Heazlewood, J. L., Millar, A. H. Isolation and subfractionation of plant mitochondria for proteomic analysis. Methods Mol Biol. 355, 49-62 (2007).
- Hao, W., Fan, S., Hua, W., Wang, H. Effective extraction and assembly methods for simultaneously obtaining plastid and mitochondrial genomes. PLoS One. 9 (9), e108291 (2014).
- Pomeroy, M. K. Studies on the respiratory properties of mitochondria isolated from developing winter wheat seedlings. Plant Physiol. 53 (4), 653-657 (1974).
- Taylor, N. L., Stroher, E., Millar, A. H. Arabidopsis organelle isolation and characterization. Methods Mol Biol. 1062, 551-572 (2014).
- Triboush, S. O., Danilenko, N. G., Davydenko, O. G. A method for isolation of chloroplast DNA and mitochondrial DNA from Sunflower. Plant Mol Biol Rep. 16 (2), 183-189 (1998).
- Pinard, R., et al. Assessment of whole genome amplification-induced bias through high-throughput, massively parallel whole genome sequencing. BMC Genomics. 7 (216), 1-21 (2006).
- Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based Nextera system. BMC Biotechnol. 13 (104), 1-10 (2013).
- Raley, C., et al. Preparation of next-generation DNA sequencing libraries from ultra-low amounts of input DNA: Application to single-molecule, real-time (SMRT) sequencing on the Pacific Biosciences RS II. bioRxiv. , (2014).
- Tsai, Y. C., et al. Resolving the Complexity of Human Skin Metagenomes Using Single-Molecule Sequencing. MBio. 7 (1), e01948 (2016).
- Feehery, G. R., et al. A method for selectively enriching microbial DNA from contaminating vertebrate host DNA. PLoS One. 8 (10), e76096 (2013).
- Yigit, E., Hernandez, D. I., Trujillo, J. T., Dimalanta, E., Bailey, C. D. Genome and metagenome sequencing: Using the human methyl-binding domain to partition genomic DNA derived from plant tissues. Appl Plant Sci. 2 (11), 1-6 (2014).
- Noyszewski, A. K., et al. Accelerated evolution of the mitochondrial genome in an alloplasmic line of durum wheat. BMC Genomics. 15 (67), 1-16 (2014).
- . QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2016)
- . User developed protocol: Isolation of genomic DNA from plants and filamentous fungi using the QIAGEN Genomic-tip – (EN) Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2001)
- . QIAGEN Genomic DNA Handbook Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2012)
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Ogihara, Y., et al. Structural dynamics of cereal mitochondrial genomes as revealed by complete nucleotide sequencing of the wheat mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 33 (19), 6235-6250 (2005).
- Ogihara, Y., et al. Structural features of a wheat plastome as revealed by complete sequencing of chloroplast DNA. Mol Genet Genomics. 266 (5), 740-746 (2002).
- International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC). A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticum aestivum) genome. Science. 345 (6194), (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Bendich, A. J. Why do chloroplasts and mitochondria contain so many copies of their genome?. Bioessays. 6 (6), 279-282 (1987).
- Kumar, R. A., Oldenburg, D. J., Bendich, A. J. Changes in DNA damage, molecular integrity, and copy number for plastid DNA and mitochondrial DNA during maize development. J Exp Bot. 65 (22), 6425-6439 (2014).
- Ma, J., Li, X. Q. Organellar genome copy number variation and integrity during moderate maturation of roots and leaves of maize seedlings. Curr Genet. 61 (4), 591-600 (2015).
- Lang, E. G., et al. Simultaneous isolation of pure and intact chloroplasts and mitochondria from moss as the basis for sub-cellular proteomics. Plant Cell Rep. 30 (2), 205-215 (2011).
- Tobin, A. K. Subcellular fractionation of plant tissues. Isolation of chloroplasts and mitochondria from leaves. Methods Mol Biol. 59, 57-68 (1996).
