अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए उपयुक्त प्लांट ऑगेलरल डीएनए संवर्धन के तरीके का अनुकूलन और तुलनात्मक विश्लेषण
Summary
दो संयंत्र ऑर्गेनेल डीएनए संवर्धन के तरीकों की तुलना और अनुकूलन प्रस्तुत किए गए हैं: मेथिलिकेशन स्थिति पर आधारित कुल जीडीएनए के पारम्परिक अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन और विभाजन। हम परिणामस्वरूप डीएनए मात्रा और गुणवत्ता का आकलन करते हैं, अगली पीढ़ी के शॉर्ट-वाचन में प्रदर्शन को प्रदर्शित करते हैं, और लंबे-पढ़े गए एकल-अणु अनुक्रमणों में उपयोग की संभावनाओं पर चर्चा करते हैं।
Abstract
प्लांट ऑ organellar जीनोम में बड़े, दोहराव वाले तत्व होते हैं जो जटिल संरचनाओं और / या उप-जीनोमिक टुकड़े बनाने के लिए युग्मन या पुन: संयोजन से गुजर सकते हैं। ऑर्गेलेर जीनोम भी किसी दिए गए सेल या टिशू प्रकार (हेटेरोप्लासी) के अंदर प्रवेश में मौजूद होते हैं, और उपप्रकार के बहुतायत में विकास के दौरान या तनाव के दौरान बदल सकता है (उप-स्टेइकीओमेट्रिक स्थानांतरण)। अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) प्रौद्योगिकियों को ऑर्गेनेल जेनोम संरचना और कार्य की गहरी समझ प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। ऑर्गेनेल डीएनए प्राप्त करने के लिए पारंपरिक अनुक्रमण के कई तरीकों का इस्तेमाल किया जाता है: (1) यदि ऊतक को शुरू करने की एक बड़ी मात्रा में उपयोग किया जाता है, तो उसे समरूपित किया जाता है और विभेदक केन्द्रोत्पादन और / या ढाल शुद्धि के अधीन होता है। (2) यदि ऊतक की एक छोटी मात्रा का प्रयोग किया जाता है ( यानी, अगर बीज, सामग्री या स्थान सीमित है), तो उसी प्रक्रिया को (1) के रूप में किया जाता है, इसके बाद पूरे जीनोम प्रवर्धन के लिए पर्याप्त डीएनए प्राप्त होता है। (3) जैव सूचना विज्ञान का विश्लेषण सीईसी के लिए किया जा सकता हैकुल जीनोमिक डीएनए का उपयोग करें और ऑर्गेनेल ने पढ़ा। इन सभी विधियों में निहित चुनौतियों और व्यापारिक अवसर हैं (1) में, ऊतक को शुरू करने की इतनी बड़ी मात्रा में प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है; (2) में, पूरे जीनोम प्रवर्धन एक अनुक्रमण पूर्वाग्रह परिचय कर सकता है; और (3) में, परमाणु और ऑर्गेनेल जेनोमों के बीच समरूपता विधानसभा और विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकती है। बड़े परमाणु जीनोमों वाले पौधों में ऑक्सीनेल डीएनए के लिए जैव सूचना विज्ञान के विश्लेषण के लिए अनुक्रमण लागत और अनुक्रम जटिलता को कम करने के लिए यह लाभप्रद है। यहां, हम एक चौथाई विधि, एक अनुकूल सीपीजी-मिथाइल पुलडाउन दृष्टिकोण के साथ एक पारंपरिक अंतर सेंटीफ्यूगेशन विधि की तुलना करते हैं, जो कि परमाणु और ऑर्गेनेल अंशों में कुल जीनोमिक डीएनए को अलग करता है। दोनों तरीकों से एनजीएस, डीएनए के लिए पर्याप्त डीएनए प्राप्त होता है जो ऑ organellar अनुक्रमों के लिए अत्यधिक समृद्ध होता है, यद्यपि मिटोचंद्रिया और क्लोरोप्लास्ट्स में विभिन्न अनुपात पर होता है। हम गेहूं के पत्तों के ऊतकों के लिए इन विधियों के अनुकूलन को पेश करते हैं और प्रमुख फायदे और डी पर चर्चा करते हैंनमूना इनपुट, प्रोटोकॉल आराम और डाउनस्ट्रीम एप्लीकेशन के संदर्भ में प्रत्येक दृष्टिकोण के फायदे हैं
Introduction
जीनोम अनुक्रमण महत्वपूर्ण पौधे लक्षणों के अंतर्निहित आनुवंशिक आधार काटना करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। अधिकांश जीनोम-अनुक्रमिक अध्ययन परमाणु जीनोम सामग्री पर ध्यान केंद्रित करते हैं, क्योंकि अधिकांश जीन नाभिक में स्थित हैं हालांकि, ऑटोनॉल्टर जीनोम (यूकेरियोट्स में) और प्लास्टिड (पौधों में, विशेष रूप से, क्लोरोप्लास्ट, प्रकाश संश्लेषण में काम करता है), जीव-जंतु विकास, तनाव प्रतिक्रिया और संपूर्ण फिटनेस 1 के लिए महत्वपूर्ण आनुवांशिक जानकारी का योगदान देता है। ऑर्गेलेर जीनोम आम तौर पर परमाणु जीनोम अनुक्रमण के लिए आवश्यक कुल डीएनए निष्कर्षों में शामिल हैं, हालांकि डीएनए निष्कर्षण से पहले ईएनजीई संख्या को कम करने के तरीकों को भी नियोजित किया जाता है 2 । कई अध्ययनों ने ऑर्गेनेल जेनोम्स 3 , 4 , 5 को इकट्ठा करने के लिए कुल जीडीएनए निकासी से अनुक्रमण परिणामों का उपयोग किया है ,Xref "> 6 , 7। हालांकि, जब ऑब्जेनेल जीनोम पर ध्यान केंद्रित करने के लिए अध्ययन का लक्ष्य है, कुल जीडीएनए का उपयोग अनुक्रमण लागत को बढ़ाता है क्योंकि कई पढ़ता है परमाणु डीएनए अनुक्रमों को" खो दिया ", विशेषकर बड़े परमाणु जीनोमों वाले पौधों में इसके अलावा, परमाणु जीनोम में और ऑर्गेनल्स के बीच ऑगनेरल अनुक्रमों के दोहराव और हस्तांतरण के कारण, उचित जीनोम को पढ़ते हुए अनुक्रमण की सही मैपिंग स्थिति को हल करना जैव-रूप से 2 , 8 को चुनौती देने वाला है। परमाणु जीनोम से ऑर्गेनेल जेनोम का शुद्धि एक है इन समस्याओं को कम करने की रणनीति। आगे की जैव सूचना विज्ञान रणनीतियों का उपयोग मितोचोन्रिया और क्लोरोप्लास्ट्स के बीच समरूपता के क्षेत्रों को उस नक्शे को पढ़ा जाने के लिए अलग किया जा सकता है।
जबकि कई पौधों की प्रजातियों के ऑ organellar जीनोम क्रमबद्ध हुए हैं, जबकि ऑ organellar जीनोम विविधता की चौड़ाई के बारे में बहुत कुछ पता हैजंगली आबादी में या खेती के प्रजनन पूल में उपलब्ध है। ऑर्गेनेर जीनोम को गतिशील अणुओं के रूप में भी जाना जाता है जो दोहराए गए अनुक्रम 9 के बीच पुनर्संयोजन के कारण महत्वपूर्ण संरचनात्मक पुनर्व्यवस्था से गुजरते हैं। इसके अलावा, ऑ organeller जीनोम की कई प्रतियां प्रत्येक अंग में समाहित होती हैं, और प्रत्येक कक्ष में कई ऑर्गेनल्स समाहित होते हैं। इन जीनोमों की सभी प्रतियां एक जैसी नहीं हैं, जिसे हेटेरोप्लासिमी के रूप में जाना जाता है। "मास्टर सर्कल्स" की कैनोनिकल तस्वीर के विपरीत, उप-जीनोमिक सर्किल, रैखिक क्रोमोसोम, रैखिक कॉंक्वैमर, और ब्रंकेड स्ट्रक्चर 10 सहित ऑ organeller जीनोम संरचनाओं की अधिक जटिल तस्वीर के लिए अब बढ़ती सबूत हैं। वनस्पति organellar जीनोमों की विधानसभा उनके अपेक्षाकृत बड़े आकारों और पर्याप्त उल्टे और प्रत्यक्ष दोहराव से जटिल है।
ऑर्गेनेल अलगाव, डीएनए शुद्धि और बाद में जेनोम के लिए पारंपरिक प्रोटोकॉल ई अनुक्रमण अक्सर बोझिल होते हैं और टिशू इनपुट के बड़े संस्करणों की आवश्यकता होती है, कई ग्रामों के साथ, प्रारंभिक बिंदु 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 के रूप में आवश्यक युवा पत्ती के ऊतक के सैकड़ों ग्रामों के ऊपर। जब यह ऊतक सीमित होता है तो यह ऑगनलार जीनोम अनुक्रमण को दुर्गम बनाता है। कुछ स्थितियों में, बीज की मात्रा सीमित होती है, जैसे कि जब पीढ़ी के आधार पर या नर बाँझ लाइनों में क्रम अनुक्रम के लिए जरूरी हो, जिसे क्रॉसिंग के जरिए बनाए रखा जाना चाहिए। इन स्थितियों में, ऑ organellar डीएनए को शुद्ध किया जा सकता है और तब पूरे जीनोम प्रवर्धन के अधीन होता है। हालांकि, पूरे जीनोम प्रवर्धन महत्वपूर्ण अनुक्रमण पक्षपात को लागू कर सकता है, जो कि संरचनात्मक विविधता, उप-जीनोमिक संरचनाओं, और हेटेरोप्लासी स्तरों का मूल्यांकन करते समय एक विशेष समस्या है> 18 लघु-पढ़ने वाली अनुक्रमण तकनीक के लिए पुस्तकालय की तैयारी में हालिया प्रगति पूरे जीनोम प्रवर्धन से बचने के लिए कम-इनपुट बाधाओं को दूर करती है। उदाहरण के लिए, इल्यूमिना नेक्टेरा एक्सटी लाइब्रेरी तैयारी किट 1 एनजी डीएनए के रूप में इनपुट 1 के रूप में इस्तेमाल होने की अनुमति देता है। हालांकि, लंबे समय से पढ़े जाने वाले अनुक्रमिक अनुप्रयोगों जैसे पीएसीबीओ या ऑक्सफोर्ड नैनोपोर अनुक्रमण तकनीकों के लिए मानक पुस्तकालय की तैयारी को अभी भी इनपुट डीएनए की अपेक्षाकृत उच्च मात्रा की आवश्यकता होती है, जो ऑ organellar जीनोम अनुक्रमण के लिए एक चुनौती रख सकता है। हाल ही में, नए यूजर-निर्मित, लंबे समय से पढ़े हुए अनुक्रमण प्रोटोकॉल को इनपुट राशियों को कम करने और नमूनों में जीनोम अनुक्रमण की सुविधा के लिए विकसित किया गया है, जहां डीएनए की माइक्रोग्राम मात्रा 20 , 21 मुश्किल है। हालांकि, उच्च-आणविक भार प्राप्त करना, इन पुस्तकालयों की तैयारी में फ़ीड करने के लिए शुद्ध ऑर्गेनेल अंशों को एक चुनौती बनी हुई है।
हमने टी की मांग कीO पूरे जीनोम प्रवर्धन की आवश्यकता के बिना एनजीएस के लिए उपयुक्त organellar डीएनए संवर्धन और अलगाव विधियों की तुलना और अनुकूलन। विशेष रूप से, हमारा लक्ष्य सीमित प्रारंभिक सामग्रियों से उच्च-आणविक वजन ऑनेलवेल डीएनए को समृद्ध करने के लिए सर्वोत्तम तरीकों का निर्धारण करना था, जैसे कि पत्ते का सब्सम्। यह काम ऑर्गेनेल डीएनए के लिए समृद्ध करने के तरीकों का तुलनात्मक विश्लेषण प्रस्तुत करता है: (1) एक संशोधित, पारंपरिक विभेदक सेंट्रिफ्यूजेशन प्रोटोकॉल बनाम (2) एक डीएनए फ्रैक्शन प्रोटोकॉल, जिस पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए सीपीजी-मिथाइल बाध्यकारी डोमेन प्रोटीन पुलडाउन दृष्टिकोण 22 संयंत्र ऊतक 23 पर लागू हम गेहूं के पत्तों के ऊतक से organellar डीएनए के अलगाव के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं की सलाह देते हैं, जिसे आसानी से अन्य पौधों और ऊतक प्रकारों तक बढ़ाया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
तिथि करने के लिए, विशिष्ट डीएनए के लिए समृद्ध करने के लिए परंपरागत डीसी पद्धतियों पर अधिकांश ऑग्नलर सिकेंजिंग अध्ययन केंद्र। विभिन्न पौधों से ऑर्गेनल्स को अलग करने के तरीके का वर्णन किया गया है, जिसम?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कृषि-कृषि अनुसंधान सेवा के संयुक्त राज्य विभाग से और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (आईओएस 1025881 और आईओएस 1361554) से धन को स्वीकार करना चाहते हैं। हम ग्रीनहाउस रखरखाव और पौधे देखभाल के लिए आर। कैस्पर का धन्यवाद करते हैं। हम मिनेसोटा यूनिवर्सिटी ऑफ यूनिवर्सिटी सेंटर का भी धन्यवाद करते हैं, जहां इलुमिना पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण की गई थी। हम पत्रिका के संपादकों और चार अज्ञात समीक्षकों की टिप्पणियों के लिए भी आभारी हैं जिन्होंने हमारी पांडुलिपि को और मजबूत किया। जापान में सहकर्मियों के साथ सहयोगी परियोजनाओं के लिए इन प्रोटोकॉल को एकीकृत करने के लिए हम एसके से फेलोशिप के लिए ओईसीडी का भी धन्यवाद करते हैं।
Materials
| 2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME) | Sigma Aldrich | M3148-100ml | |
| 2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagent | Sigma Aldrich | I9516 | |
| agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agarose | Bio-Rad | 1613108 | |
| analytical balance | Mettler Toledo | AB54-S | |
| balance | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | B4287-25G | |
| Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8in | SPEX SamplePrep | 2183 | |
| Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 ml tubes | SPEX SamplePrep | 2664 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| ethanol, absolute | Decon Laboratories | 2716 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5M Solution, pH8.0 | Fisher | BP2482-500 | |
| gel imaging system | |||
| gel stain | Such as GelRed or Ethidium Bromide | ||
| grinding pestle, wide tip for 2 ml conical tubes | |||
| Guanidine-HCl, 8M solution | ThermoFisher | 24115 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| liquid nitrogen | |||
| Lysing enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma | L1412 | |
| Magnesium Chloride | G Bioscience | 24115 | |
| magnetic rack | ThermoFisher | A13346 | |
| microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 ml | Eppendorf | 22431021 | |
| microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 ml | Eppendorf | ||
| microcentrifuge, refrigerated | Sorvall | Legend X1R | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 ml tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 ml tubes |
| microcentrifuge, room temperature | Eppendorf | 5424 | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes |
| Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | MRCFOR100 | |
| Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnel | EMD Millipore | 475855 | |
| NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit | New England Biolabs | E2612L | |
| parafilm | Parafilm M | PM992 | |
| plastic pots and trays | |||
| polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher | BP431-100 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III) | Bio-Rad | 1703697 | |
| purification beads, Agencourt AMpureXP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | |
| Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction Kit | Qiagen | 10223 | |
| Qiagen Buffer EB (elution buffer) | Qiagen | 19086 | |
| Qiagen DNA Extraction Buffer Set | Qiagen | 19060 | |
| QiaRack | Qiagen | 19015 | |
| qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480) | Roche | ||
| qPCR plate sealing film | Roche | 4729757001 | |
| qPCR plate, 96 well plate | Roche | 4729692001 | |
| Qubit assay tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit Broad Spectrum assay kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit High Sensitivity assay kit | Life Technologies | Q32851 | |
| RNaseA | Qiagen | 19101 | |
| Serological pipettes (20 ml) and pipet-aid | Fisher | 13-678-11 | |
| Small funnels, 1 per sample | |||
| Sodium Chloride | Ambion | AM9759 | |
| Soft paintbrush, 2 per sample | |||
| SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizer | SPEX SamplePrep | Or another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced. | |
| Sucrose | Omnipure | 8550 | |
| TBE | |||
| thermomixer | |||
| Tris | Sigma | T2819-100ml | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| tube rotater | |||
| tubes, 50 mL conical polypropylene | Corning | 352070 | |
| tubes, 50 ml high-speed polypropylene | ThermoScientific/Nalgene | 3119-0050 | e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent |
| vermiculite | |||
| water bath | |||
| water, sterile and certified Nuclease-free | Fisher | 1481 | |
| water, sterile milliQ |
Referências
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