Optimalisering og sammenligningsanalyse av organellar DNA-berigelsesmetoder som er egnet for neste generasjons sekvensering
Summary
Sammenligningen og optimaliseringen av to organellar DNA-anrikningsmetoder presenteres: Tradisjonell differensial sentrifugering og fraksjonering av totalt gDNA basert på metyleringsstatus. Vi vurderer den resulterende DNA-kvantiteten og kvaliteten, demonstrerer ytelse i kortlestende neste generasjons sekvensering, og drøfter potensialet for bruk i langlestende enkeltmolekylesekvensering.
Abstract
Plantorganellgenomer inneholder store, repeterende elementer som kan gjennomgå parring eller rekombinasjon for å danne komplekse strukturer og / eller sub-genomiske fragmenter. Organellargener finnes også i blandinger i en gitt celle eller vevstype (heteroplasm), og en overflod av subtyper kan endres gjennom utvikling eller når det er under stress (substøkiometrisk forskyvning). Next-generation sequencing (NGS) teknologier er nødvendig for å få dypere forståelse av organellar genom struktur og funksjon. Tradisjonelle sekvenseringsstudier bruker flere metoder for å oppnå organellært DNA: (1) Hvis en stor mengde startvev anvendes, blir den homogenisert og underkastet differensiell sentrifugering og / eller gradientrensing. (2) Hvis en mindre mengde vev er brukt ( dvs. hvis frø, materiale eller rom er begrenset), utføres samme prosess som i (1), etterfulgt av hel-genom-amplifisering for å oppnå tilstrekkelig DNA. (3) Bioinformatikkanalyse kan brukes til å seqUence det totale genomiske DNA og å analysere organellar leser. Alle disse metodene har iboende utfordringer og avvik. I (1) kan det være vanskelig å oppnå en så stor mengde startvev; I (2) kunne helgenom forsterkning innføre en sekvenseringsforspenning; Og i (3) kan homologi mellom atom- og organellargener forstyrre montering og analyse. I planter med store atomgener er det fordelaktig å berike for organellært DNA for å redusere sekvenseringskostnader og sekvenskompleksitet for bioinformatikkanalyser. Her sammenligner vi en tradisjonell differensial sentrifugeringsmetode med en fjerde metode, en tilpasset CpG-metyl-nedtrekks-tilnærming, for å separere det totale genomiske DNA i kjernefysiske og organelle fraksjoner. Begge metodene gir tilstrekkelig DNA for NGS, DNA som er høyt beriket for organellære sekvenser, om enn i forskjellige forhold i mitokondrier og kloroplaster. Vi presenterer optimaliseringen av disse metodene for hvetebladvev og diskuterer store fordeler og dUlemper ved hver tilnærming i sammenheng med prøveinngang, protokolllette og nedstrømsapplikasjon.
Introduction
Genomsekvensering er et kraftig verktøy for å dissekere det underliggende genetiske grunnlaget for viktige plantegenskaper. De fleste genomsekventeringsstudier fokuserer på atomgenometinninnholdet, da flertallet av gener ligger i kjernen. Organellargener, inkludert mitokondriene (på tvers av eukaryoter) og plastider (i planter, spesialisert form, kloroplast, arbeider i fotosyntese) bidrar imidlertid til betydelig genetisk informasjon som er avgjørende for organisasjonsutvikling, stressrespons og total kondisjon 1 . Organellargener er typisk inkludert i totale DNA-ekstrakter beregnet for nukleär genom-sekvensering, selv om metoder for å redusere organelle tall før DNA-ekstraksjon også benyttes 2 . Mange studier har brukt sekvenseringsresultater fra totale gDNA ekstraksjoner for å samle organellar genomene 3 , 4 , 5 ,Xref "> 6 , 7. Men når målet for studien er å fokusere på organellargener, øker bruk av total gDNA sekvenseringskostnadene fordi mange leser er" tapt "til kjernefysiske DNA-sekvensene, særlig i planter med store atomgener . Dessuten, på grunn av duplisering og overføring av organellar sekvenser i det nukleære genom og mellom organeller, løse den riktige tilordning stilling av sekvense leser til den riktige genomet er bioinformatically utfordrende 2, 8. rensingen av organellar genomer fra den nukleære genom er ett Strategi for å redusere disse problemene. Ytterligere bioinformatikk strategier kan brukes til å skille leser det kartet til regioner av homologi mellom mitokondriene og kloroplaster.
Mens organellargenene fra mange plantearter er blitt sekvensert, er lite kjent om bredden av organellargenoms mangfoldTilgjengelig i villpopulasjoner eller i dyrkede avlspuljer. Organellærgener er også kjent for å være dynamiske molekyler som gjennomgår betydelig strukturell omlegging på grunn av rekombinasjon mellom gjentasekvenser 9 . Videre er flere kopier av organellargenomet inneholdt i hver organell, og flere organeller er inneholdt i hver celle. Ikke alle kopier av disse genomene er identiske, som er kjent som heteroplasmisk. I motsetning til det kanoniske bildet av "master sirkler", er det nå voksende bevis for et mer komplekst bilde av organellar genom strukturer, inkludert sub-genomiske sirkler, lineære kromosomer, lineære concatamers og forgrenede strukturer 10 . Samlingen av planteorganellgener er ytterligere komplisert av deres forholdsvis store størrelser og betydelige inverterte og direkte gjentagelser.
Tradisjonelle protokoller for organellær isolasjon, DNA rensing og etterfølgende gen E-sekvensering er ofte besværlig og krever store mengder vevsinngang, med flere gram oppover på hundrevis av gram ungt bladvev som er nødvendig som utgangspunkt 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Dette gjør organellargenomsekvensering utilgjengelig når vev er begrenset. I noen situasjoner er frømengder begrenset, for eksempel når det er nødvendig å sekvensere på generasjonsbasis eller i mannlige sterile linjer som må opprettholdes ved kryssing. I disse situasjonene kan organellar-DNA bli renset og deretter utsatt for hel-genom-amplifisering. Imidlertid kan helgenomforsterkning introdusere signifikant sekvenseringsforspenning, hvilket er et spesielt problem når man vurderer strukturell variasjon, sub-genomiske strukturer og heteroplasminnivåer> 18. Nylige fremskritt i biblioteket forberedelse for kortleste sekvensering teknologier har overvinne lav-inngangsbarrierer for å unngå hel-genom forsterkning. For eksempel tillater Illumina Nextera XT-bibliotekets forberedelsessett så lite som 1 ng DNA som skal brukes som inngang 19 . Standardbibliotekspreparasjoner for langleste sekvenseringsapplikasjoner, som for eksempel PacBio eller Oxford Nanopore-sekvenseringsteknologi, krever imidlertid fortsatt en relativt høy mengde inngangsd DNA, som kan utgjøre en utfordring for organellær genom-sekvensering. Nylig er nye, brukervennlige, langleste sekvenseringsprotokoller blitt utviklet for å redusere inngangsmengder og for å bidra til å fremme genom-sekvensering i prøver hvor det er vanskelig å få mikrogram-mengder av DNA 20 , 21 . Imidlertid er oppnåelse av høymolekylære, rene organellære fraksjoner for å matche inn i disse bibliotekspreparatene en utfordring.
Vi søkte tO sammenligne og optimalisere organellar DNA-anriknings- og isoleringsmetoder egnet for NGS uten behov for helgenomdannelse. Spesielt var målet vårt å bestemme beste praksis for å berike for organellært DNA med høy molekylvekt fra begrensede utgangsmaterialer, for eksempel en undersampling av et blad. Dette arbeidet presenterer en komparativ analyse av metoder for å berike for organellært DNA: (1) en modifisert, tradisjonell differensialsentrifugeringsprotokoll versus (2) en DNA-fraksjonsprotokoll basert på bruk av et kommersielt tilgjengelig DNA-CpG-metylbindende domeneprotein-nedtrekks-tilnærming 22 påført plantevev 23 . Vi anbefaler beste praksis for isolering av organellar DNA fra hveteblad vev, som lett kan utvides til andre planter og vevstyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Til dags dato, de fleste organellar sekvensering studier senter på tradisjonelle DC metoder for å berike for bestemt DNA. Metoder for å isolere organeller fra forskjellige planter har blitt beskrevet, inkludert mose 40 ; Monokotter som hvete 15 og havre 11 ; Og dikoter som arabidopsis 11 , solsikke 17 og rapsfrø 14 . De fleste protokoller fokuserer på bladvev <sup class="xr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å anerkjenne finansiering fra USAs Department of Agriculture-Agricultural Research Service og fra National Science Foundation (IOS 1025881 og IOS 1361554). Vi takker R. Caspers for vedlikehold av drivhus og plantepleie. Vi takker også Universitetet i Minnesota Genomics Center, hvor Illumina biblioteket forberedelser og sekvensering ble utført. Vi er også takknemlige for kommentarene fra journalredaktørene og fire anonyme anmeldere som styrket vårt manuskript ytterligere. Vi takker også OECD for et fellesskap til SK for å integrere disse protokollene for samarbeidsprosjekter med kolleger i Japan.
Materials
| 2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME) | Sigma Aldrich | M3148-100ml | |
| 2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagent | Sigma Aldrich | I9516 | |
| agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agarose | Bio-Rad | 1613108 | |
| analytical balance | Mettler Toledo | AB54-S | |
| balance | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | B4287-25G | |
| Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8in | SPEX SamplePrep | 2183 | |
| Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 ml tubes | SPEX SamplePrep | 2664 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| ethanol, absolute | Decon Laboratories | 2716 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5M Solution, pH8.0 | Fisher | BP2482-500 | |
| gel imaging system | |||
| gel stain | Such as GelRed or Ethidium Bromide | ||
| grinding pestle, wide tip for 2 ml conical tubes | |||
| Guanidine-HCl, 8M solution | ThermoFisher | 24115 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| liquid nitrogen | |||
| Lysing enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma | L1412 | |
| Magnesium Chloride | G Bioscience | 24115 | |
| magnetic rack | ThermoFisher | A13346 | |
| microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 ml | Eppendorf | 22431021 | |
| microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 ml | Eppendorf | ||
| microcentrifuge, refrigerated | Sorvall | Legend X1R | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 ml tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 ml tubes |
| microcentrifuge, room temperature | Eppendorf | 5424 | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes |
| Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | MRCFOR100 | |
| Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnel | EMD Millipore | 475855 | |
| NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit | New England Biolabs | E2612L | |
| parafilm | Parafilm M | PM992 | |
| plastic pots and trays | |||
| polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher | BP431-100 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III) | Bio-Rad | 1703697 | |
| purification beads, Agencourt AMpureXP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | |
| Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction Kit | Qiagen | 10223 | |
| Qiagen Buffer EB (elution buffer) | Qiagen | 19086 | |
| Qiagen DNA Extraction Buffer Set | Qiagen | 19060 | |
| QiaRack | Qiagen | 19015 | |
| qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480) | Roche | ||
| qPCR plate sealing film | Roche | 4729757001 | |
| qPCR plate, 96 well plate | Roche | 4729692001 | |
| Qubit assay tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit Broad Spectrum assay kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit High Sensitivity assay kit | Life Technologies | Q32851 | |
| RNaseA | Qiagen | 19101 | |
| Serological pipettes (20 ml) and pipet-aid | Fisher | 13-678-11 | |
| Small funnels, 1 per sample | |||
| Sodium Chloride | Ambion | AM9759 | |
| Soft paintbrush, 2 per sample | |||
| SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizer | SPEX SamplePrep | Or another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced. | |
| Sucrose | Omnipure | 8550 | |
| TBE | |||
| thermomixer | |||
| Tris | Sigma | T2819-100ml | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| tube rotater | |||
| tubes, 50 mL conical polypropylene | Corning | 352070 | |
| tubes, 50 ml high-speed polypropylene | ThermoScientific/Nalgene | 3119-0050 | e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent |
| vermiculite | |||
| water bath | |||
| water, sterile and certified Nuclease-free | Fisher | 1481 | |
| water, sterile milliQ |
Referências
- Liberatore, K. L., Dukowic-Schulze, S., Miller, M. E., Chen, C., Kianian, S. F. The role of mitochondria in plant development and stress tolerance. Free Radic Biol Med. 100, 238-256 (2016).
- Samaniego Castruita, J. A., Zepeda Mendoza, M. L., Barnett, R., Wales, N., Gilbert, M. T. Odintifier–A computational method for identifying insertions of organellar origin from modern and ancient high-throughput sequencing data based on haplotype phasing. BMC Bioinformatics. 16 (232), 1-13 (2015).
- Zhang, T., Zhang, X., Hu, S., Yu, J. An efficient procedure for plant organellar genome assembly, based on whole genome data from the 454 GS FLX sequencing platform. Plant Methods. 7 (38), 1-8 (2011).
- Wambugu, P. W., Brozynska, M., Furtado, A., Waters, D. L., Henry, R. J. Relationships of wild and domesticated rices (Oryza AA genome species) based upon whole chloroplast genome sequences. Sci Rep. 5 (13957), 1-9 (2015).
- Iorizzo, M., et al. De novo assembly of the carrot mitochondrial genome using next generation sequencing of whole genomic DNA provides first evidence of DNA transfer into an angiosperm plastid genome. BMC Plant Biol. 12 (61), 1-17 (2012).
- Park, S., et al. Complete sequences of organelle genomes from the medicinal plant Rhazya stricta (Apocynaceae) and contrasting patterns of mitochondrial genome evolution across asterids. BMC Genomics. 15 (405), 1-18 (2014).
- Skippington, E., Barkman, T. J., Rice, D. W., Palmer, J. D. Miniaturized mitogenome of the parasitic plant Viscum scurruloideum is extremely divergent and dynamic and has lost all nad genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (27), E3515-E3524 (2015).
- Wicke, S., Schneeweiss, G. M., Hörandl, E., Appelhans, M. Chapter 1. Next Generation Sequencing in Plant Systematics. , (2015).
- Sloan, D. B. One ring to rule them all? Genome sequencing provides new insights into the ‘master circle’ model of plant mitochondrial DNA structure. New Phytol. 200 (4), 978-985 (2013).
- Woloszynska, M. Heteroplasmy and stoichiometric complexity of plant mitochondrial genomes–though this be madness, yet there’s method in’t. J Exp Bot. 61 (3), 657-671 (2010).
- Ahmed, Z., Fu, Y. B. An improved method with a wider applicability to isolate plant mitochondria for mtDNA extraction. Plant Methods. 11 (56), 1-11 (2015).
- Ejaz, M., et al. Comparison of small scale methods for the rapid and efficient extraction of mitochondrial DNA from wheat crop suitable for down-stream processes. Genet Mol Res. 13 (4), 10320-10331 (2014).
- Eubel, H., Heazlewood, J. L., Millar, A. H. Isolation and subfractionation of plant mitochondria for proteomic analysis. Methods Mol Biol. 355, 49-62 (2007).
- Hao, W., Fan, S., Hua, W., Wang, H. Effective extraction and assembly methods for simultaneously obtaining plastid and mitochondrial genomes. PLoS One. 9 (9), e108291 (2014).
- Pomeroy, M. K. Studies on the respiratory properties of mitochondria isolated from developing winter wheat seedlings. Plant Physiol. 53 (4), 653-657 (1974).
- Taylor, N. L., Stroher, E., Millar, A. H. Arabidopsis organelle isolation and characterization. Methods Mol Biol. 1062, 551-572 (2014).
- Triboush, S. O., Danilenko, N. G., Davydenko, O. G. A method for isolation of chloroplast DNA and mitochondrial DNA from Sunflower. Plant Mol Biol Rep. 16 (2), 183-189 (1998).
- Pinard, R., et al. Assessment of whole genome amplification-induced bias through high-throughput, massively parallel whole genome sequencing. BMC Genomics. 7 (216), 1-21 (2006).
- Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based Nextera system. BMC Biotechnol. 13 (104), 1-10 (2013).
- Raley, C., et al. Preparation of next-generation DNA sequencing libraries from ultra-low amounts of input DNA: Application to single-molecule, real-time (SMRT) sequencing on the Pacific Biosciences RS II. bioRxiv. , (2014).
- Tsai, Y. C., et al. Resolving the Complexity of Human Skin Metagenomes Using Single-Molecule Sequencing. MBio. 7 (1), e01948 (2016).
- Feehery, G. R., et al. A method for selectively enriching microbial DNA from contaminating vertebrate host DNA. PLoS One. 8 (10), e76096 (2013).
- Yigit, E., Hernandez, D. I., Trujillo, J. T., Dimalanta, E., Bailey, C. D. Genome and metagenome sequencing: Using the human methyl-binding domain to partition genomic DNA derived from plant tissues. Appl Plant Sci. 2 (11), 1-6 (2014).
- Noyszewski, A. K., et al. Accelerated evolution of the mitochondrial genome in an alloplasmic line of durum wheat. BMC Genomics. 15 (67), 1-16 (2014).
- . QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2016)
- . User developed protocol: Isolation of genomic DNA from plants and filamentous fungi using the QIAGEN Genomic-tip – (EN) Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2001)
- . QIAGEN Genomic DNA Handbook Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2012)
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Ogihara, Y., et al. Structural dynamics of cereal mitochondrial genomes as revealed by complete nucleotide sequencing of the wheat mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 33 (19), 6235-6250 (2005).
- Ogihara, Y., et al. Structural features of a wheat plastome as revealed by complete sequencing of chloroplast DNA. Mol Genet Genomics. 266 (5), 740-746 (2002).
- International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC). A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticum aestivum) genome. Science. 345 (6194), (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Bendich, A. J. Why do chloroplasts and mitochondria contain so many copies of their genome?. Bioessays. 6 (6), 279-282 (1987).
- Kumar, R. A., Oldenburg, D. J., Bendich, A. J. Changes in DNA damage, molecular integrity, and copy number for plastid DNA and mitochondrial DNA during maize development. J Exp Bot. 65 (22), 6425-6439 (2014).
- Ma, J., Li, X. Q. Organellar genome copy number variation and integrity during moderate maturation of roots and leaves of maize seedlings. Curr Genet. 61 (4), 591-600 (2015).
- Lang, E. G., et al. Simultaneous isolation of pure and intact chloroplasts and mitochondria from moss as the basis for sub-cellular proteomics. Plant Cell Rep. 30 (2), 205-215 (2011).
- Tobin, A. K. Subcellular fractionation of plant tissues. Isolation of chloroplasts and mitochondria from leaves. Methods Mol Biol. 59, 57-68 (1996).
