Оптимизация и сравнительный анализ методов обогащения органической ДНК растений, подходящих для последующей последовательности следующего поколения
Summary
Представлено сравнение и оптимизация двух методов растительного органелларного ДНК: традиционное дифференциальное центрифугирование и фракционирование общей гДНК на основе статуса метилирования. Мы оцениваем полученное количество и качество ДНК, демонстрируем эффективность в короткометражном секвенировании следующего поколения и обсуждаем потенциал для использования в долгочитаемом одномолекулярном секвенировании.
Abstract
Органные органные геномы растений содержат большие повторяющиеся элементы, которые могут подвергаться спариванию или рекомбинации с образованием сложных структур и / или подгеномных фрагментов. Органелларные геномы также существуют в смесях в пределах определенного клеточного или тканевого типа (гетероплазмы), а обилие подтипов может изменяться во время развития или при стрессе (субстехиометрическое смещение). Для более глубокого понимания структуры и функции органелларного генома необходимы технологии секвенирования следующего поколения (NGS). Традиционные исследования секвенирования используют несколько методов для получения органеллярной ДНК: (1) Если используется большое количество исходной ткани, оно гомогенизируется и подвергается дифференциальной центрифугированию и / или градиентной очистке. (2) Если используется меньшее количество ткани ( т. Е. Если семена, материал или пространство ограничены), тот же процесс выполняется, как и в (1), за которым следует амплификация всего генома для получения достаточной ДНК. (3) Анализ биоинформатики может быть использован дляСуммарную геномную ДНК и разобрать органолептические прочтения. Все эти методы имеют присущие проблемы и компромиссы. В (1) может быть трудно получить такое большое количество исходной ткани; В (2) усиление цельного генома может привести к смещению последовательности; И в (3) гомология между ядерными и органелларными геномами может мешать сбору и анализу. В растениях с крупными ядерными геномами выгодно обогащать органеральную ДНК, чтобы снизить затраты на секвенирование и сложность последовательности для анализа биоинформатики. Здесь мы сравниваем традиционный метод дифференциального центрифугирования с четвертым методом, адаптированным подходом CpG-methyl pulldown, для разделения общей геномной ДНК на ядерные и органеарные фракции. Оба метода дают достаточную ДНК для NGS, ДНК, которая сильно обогащена для органеллярных последовательностей, хотя и при различных соотношениях в митохондриях и хлоропластах. Мы представляем оптимизацию этих методов для ткани листьев пшеницы и обсуждаем основные преимущества и dЯвляется преимуществом каждого подхода в контексте ввода образца, упрощения протокола и последующего приложения.
Introduction
Секвенирование геномов является мощным инструментом для анализа лежащей в основе генетической основы важных признаков растений. В большинстве исследований секвенирования генома основное внимание уделяется содержанию ядерного генома, так как большинство генов расположено в ядре. Тем не менее, органелл геномов, в том числе митохондрии (через эукариот) и пластид (в растениях; специализированной форме, хлоропластов, работает в фотосинтезе) способствуют значительной генетической информации , необходимой для организменном развития, реакции на стресс и общей пригодности 1. Органелларные геномы обычно включаются в общую экстракцию ДНК, предназначенную для секвенирования ядерного генома, хотя также используются методы уменьшения количества органелл до экстракции ДНК 2 . Во многих исследованиях были использованы результаты секвенирования от полных выделений гДНК для сборки органеллярных геномов 3 , 4 , 5 ,Xref "> 6 , 7. Однако, когда целью исследования является фокусирование на органелларных геномах, использование общей гДНК увеличивает затраты на секвенирование, потому что многие чтения« теряются »для последовательностей ядерных ДНК, особенно у растений с большими ядерными геномами Кроме того, из-за дублирования и переноса органелларных последовательностей в ядерный геном и между органеллами правильное отображение положения секвенирования, считываемое в соответствующий геном, является биоинформационно сложным 2 , 8. Очистка органелларных геномов от ядерного генома является одной Стратегия по уменьшению этих проблем. Дальнейшие стратегии биоинформатики могут использоваться для разделения чтений, которые сопоставляются с областями гомологии между митохондриями и хлоропластами.
В то время как органелларные геномы многих видов растений были секвенированы, мало что известно о широте разнообразия органелларного геномаДоступных в диких популяциях или в культивируемых племенных пулах. Известно, что органелларные геномы являются динамическими молекулами, которые подвергаются значительной структурной перестройке из-за рекомбинации между повторяющимися последовательностями 9 . Кроме того, в каждой органелле содержится несколько копий органомерного генома, и в каждой клетке содержится множество органелл. Не все копии этих геномов идентичны, что называется гетероплазмой. В отличие от канонической картины «мастер-кругов», в настоящее время растут доказательства более сложной картины органелларных структур генома, включая субгеномные круги, линейные хромосомы, линейные конкатэмеры и разветвленные структуры 10 . Сборка растительных органелларных геномов дополнительно осложняется их относительно большими размерами и существенными инвертированными и прямыми повторами.
Традиционные протоколы для органолептической изоляции, очистки ДНК и последующего генома E sequencing часто громоздки и требуют больших объемов ввода ткани, с несколькими граммами до более сотни граммов молодой листовой ткани, необходимой в качестве отправной точки 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Это делает секрецию органелларного генома недоступным, когда ткань ограничена. В некоторых ситуациях количество семян ограничено, например, когда необходимо последовательность на основе поколений или в мужских стерильных линиях, которые необходимо поддерживать путем скрещивания. В этих ситуациях органелларная ДНК может быть очищена, а затем подвергнута амплификации цельного генома. Однако амплификация цельного генома может привести к существенному смещению последовательности, что является особой проблемой при оценке структурных изменений, подгеномных структур и уровней гетероплазмы> 18. Недавние успехи в подготовке библиотек для технологий короткого чтения с чередованием преодолели барьеры с низким входным потенциалом, чтобы избежать усиления цельного генома. Например, набор для подготовки библиотеки Illumina Nextera XT позволяет использовать всего лишь 1 нг ДНК для ввода 19 . Тем не менее, стандартная подготовка библиотек для приложений с длительным чтением, таких как технологии секвенирования PacBio или Oxford Nanopore, по-прежнему требует относительно большого количества входной ДНК, что может создать проблему для секвенирования органелларного генома. Недавно были разработаны новые пользовательские протоколы последовательного кодирования с длительным чтением для уменьшения количества вводимых количеств и для облегчения секвенирования генома в образцах, где получение микрограммовых количеств ДНК затруднено 20 , 21 . Однако получение высокомолекулярных чистых органелларных фракций для подачи в эти библиотечные препараты остается проблемой.
Мы искали tO сравнить и оптимизировать органические методы обогащения и выделения ДНК, подходящие для NGS, без необходимости амплификации цельного генома. В частности, наша цель заключалась в определении оптимальных методов обогащения высокомолекулярной органелларной ДНК из ограниченных исходных материалов, таких как подвыборка листа. В этой работе представлен сравнительный анализ методов обогащения органелларной ДНК: (1) модифицированный традиционный протокол дифференциального центрифугирования по сравнению с (2) протоколом фракционирования ДНК на основе использования коммерчески доступного подхода к распаду ДНК CpG-метилсвязывающего домена 22 применяется к растительной ткани 23 . Мы рекомендуем лучшие методы для выделения органелларной ДНК из ткани листьев пшеницы, которая может быть легко распространена на другие растения и типы тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
На сегодняшний день большинство исследований органолептических секвенирования сосредоточены на традиционных методах DC, чтобы обогатить специфическую ДНК. Были описаны способы выделения органелл из различных растений, включая мох 40 ; Однодольные, такие как пшеница <sup class…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы отметить финансирование со стороны Министерства сельского хозяйства США по сельскохозяйственным исследованиям и Национального научного фонда (IOS 1025881 и IOS 1361554). Мы благодарим Р. Каспера за техобслуживание и уход за теплицами. Мы также благодарим Университет Миннесотского геномического центра, где были подготовлены и упорядочены библиотеки Illumina. Мы также благодарны за комментарии редакторов журнала и четырех анонимных рецензентов, которые еще больше укрепили нашу рукопись. Мы также благодарим ОЭСР за стипендию SK по интеграции этих протоколов для совместных проектов с коллегами из Японии.
Materials
| 2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME) | Sigma Aldrich | M3148-100ml | |
| 2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagent | Sigma Aldrich | I9516 | |
| agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agarose | Bio-Rad | 1613108 | |
| analytical balance | Mettler Toledo | AB54-S | |
| balance | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | B4287-25G | |
| Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8in | SPEX SamplePrep | 2183 | |
| Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 ml tubes | SPEX SamplePrep | 2664 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| ethanol, absolute | Decon Laboratories | 2716 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5M Solution, pH8.0 | Fisher | BP2482-500 | |
| gel imaging system | |||
| gel stain | Such as GelRed or Ethidium Bromide | ||
| grinding pestle, wide tip for 2 ml conical tubes | |||
| Guanidine-HCl, 8M solution | ThermoFisher | 24115 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| liquid nitrogen | |||
| Lysing enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma | L1412 | |
| Magnesium Chloride | G Bioscience | 24115 | |
| magnetic rack | ThermoFisher | A13346 | |
| microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 ml | Eppendorf | 22431021 | |
| microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 ml | Eppendorf | ||
| microcentrifuge, refrigerated | Sorvall | Legend X1R | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 ml tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 ml tubes |
| microcentrifuge, room temperature | Eppendorf | 5424 | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes |
| Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | MRCFOR100 | |
| Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnel | EMD Millipore | 475855 | |
| NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit | New England Biolabs | E2612L | |
| parafilm | Parafilm M | PM992 | |
| plastic pots and trays | |||
| polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher | BP431-100 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III) | Bio-Rad | 1703697 | |
| purification beads, Agencourt AMpureXP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | |
| Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction Kit | Qiagen | 10223 | |
| Qiagen Buffer EB (elution buffer) | Qiagen | 19086 | |
| Qiagen DNA Extraction Buffer Set | Qiagen | 19060 | |
| QiaRack | Qiagen | 19015 | |
| qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480) | Roche | ||
| qPCR plate sealing film | Roche | 4729757001 | |
| qPCR plate, 96 well plate | Roche | 4729692001 | |
| Qubit assay tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit Broad Spectrum assay kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit High Sensitivity assay kit | Life Technologies | Q32851 | |
| RNaseA | Qiagen | 19101 | |
| Serological pipettes (20 ml) and pipet-aid | Fisher | 13-678-11 | |
| Small funnels, 1 per sample | |||
| Sodium Chloride | Ambion | AM9759 | |
| Soft paintbrush, 2 per sample | |||
| SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizer | SPEX SamplePrep | Or another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced. | |
| Sucrose | Omnipure | 8550 | |
| TBE | |||
| thermomixer | |||
| Tris | Sigma | T2819-100ml | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| tube rotater | |||
| tubes, 50 mL conical polypropylene | Corning | 352070 | |
| tubes, 50 ml high-speed polypropylene | ThermoScientific/Nalgene | 3119-0050 | e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent |
| vermiculite | |||
| water bath | |||
| water, sterile and certified Nuclease-free | Fisher | 1481 | |
| water, sterile milliQ |
Referências
- Liberatore, K. L., Dukowic-Schulze, S., Miller, M. E., Chen, C., Kianian, S. F. The role of mitochondria in plant development and stress tolerance. Free Radic Biol Med. 100, 238-256 (2016).
- Samaniego Castruita, J. A., Zepeda Mendoza, M. L., Barnett, R., Wales, N., Gilbert, M. T. Odintifier–A computational method for identifying insertions of organellar origin from modern and ancient high-throughput sequencing data based on haplotype phasing. BMC Bioinformatics. 16 (232), 1-13 (2015).
- Zhang, T., Zhang, X., Hu, S., Yu, J. An efficient procedure for plant organellar genome assembly, based on whole genome data from the 454 GS FLX sequencing platform. Plant Methods. 7 (38), 1-8 (2011).
- Wambugu, P. W., Brozynska, M., Furtado, A., Waters, D. L., Henry, R. J. Relationships of wild and domesticated rices (Oryza AA genome species) based upon whole chloroplast genome sequences. Sci Rep. 5 (13957), 1-9 (2015).
- Iorizzo, M., et al. De novo assembly of the carrot mitochondrial genome using next generation sequencing of whole genomic DNA provides first evidence of DNA transfer into an angiosperm plastid genome. BMC Plant Biol. 12 (61), 1-17 (2012).
- Park, S., et al. Complete sequences of organelle genomes from the medicinal plant Rhazya stricta (Apocynaceae) and contrasting patterns of mitochondrial genome evolution across asterids. BMC Genomics. 15 (405), 1-18 (2014).
- Skippington, E., Barkman, T. J., Rice, D. W., Palmer, J. D. Miniaturized mitogenome of the parasitic plant Viscum scurruloideum is extremely divergent and dynamic and has lost all nad genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (27), E3515-E3524 (2015).
- Wicke, S., Schneeweiss, G. M., Hörandl, E., Appelhans, M. Chapter 1. Next Generation Sequencing in Plant Systematics. , (2015).
- Sloan, D. B. One ring to rule them all? Genome sequencing provides new insights into the ‘master circle’ model of plant mitochondrial DNA structure. New Phytol. 200 (4), 978-985 (2013).
- Woloszynska, M. Heteroplasmy and stoichiometric complexity of plant mitochondrial genomes–though this be madness, yet there’s method in’t. J Exp Bot. 61 (3), 657-671 (2010).
- Ahmed, Z., Fu, Y. B. An improved method with a wider applicability to isolate plant mitochondria for mtDNA extraction. Plant Methods. 11 (56), 1-11 (2015).
- Ejaz, M., et al. Comparison of small scale methods for the rapid and efficient extraction of mitochondrial DNA from wheat crop suitable for down-stream processes. Genet Mol Res. 13 (4), 10320-10331 (2014).
- Eubel, H., Heazlewood, J. L., Millar, A. H. Isolation and subfractionation of plant mitochondria for proteomic analysis. Methods Mol Biol. 355, 49-62 (2007).
- Hao, W., Fan, S., Hua, W., Wang, H. Effective extraction and assembly methods for simultaneously obtaining plastid and mitochondrial genomes. PLoS One. 9 (9), e108291 (2014).
- Pomeroy, M. K. Studies on the respiratory properties of mitochondria isolated from developing winter wheat seedlings. Plant Physiol. 53 (4), 653-657 (1974).
- Taylor, N. L., Stroher, E., Millar, A. H. Arabidopsis organelle isolation and characterization. Methods Mol Biol. 1062, 551-572 (2014).
- Triboush, S. O., Danilenko, N. G., Davydenko, O. G. A method for isolation of chloroplast DNA and mitochondrial DNA from Sunflower. Plant Mol Biol Rep. 16 (2), 183-189 (1998).
- Pinard, R., et al. Assessment of whole genome amplification-induced bias through high-throughput, massively parallel whole genome sequencing. BMC Genomics. 7 (216), 1-21 (2006).
- Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based Nextera system. BMC Biotechnol. 13 (104), 1-10 (2013).
- Raley, C., et al. Preparation of next-generation DNA sequencing libraries from ultra-low amounts of input DNA: Application to single-molecule, real-time (SMRT) sequencing on the Pacific Biosciences RS II. bioRxiv. , (2014).
- Tsai, Y. C., et al. Resolving the Complexity of Human Skin Metagenomes Using Single-Molecule Sequencing. MBio. 7 (1), e01948 (2016).
- Feehery, G. R., et al. A method for selectively enriching microbial DNA from contaminating vertebrate host DNA. PLoS One. 8 (10), e76096 (2013).
- Yigit, E., Hernandez, D. I., Trujillo, J. T., Dimalanta, E., Bailey, C. D. Genome and metagenome sequencing: Using the human methyl-binding domain to partition genomic DNA derived from plant tissues. Appl Plant Sci. 2 (11), 1-6 (2014).
- Noyszewski, A. K., et al. Accelerated evolution of the mitochondrial genome in an alloplasmic line of durum wheat. BMC Genomics. 15 (67), 1-16 (2014).
- . QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2016)
- . User developed protocol: Isolation of genomic DNA from plants and filamentous fungi using the QIAGEN Genomic-tip – (EN) Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2001)
- . QIAGEN Genomic DNA Handbook Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2012)
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Ogihara, Y., et al. Structural dynamics of cereal mitochondrial genomes as revealed by complete nucleotide sequencing of the wheat mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 33 (19), 6235-6250 (2005).
- Ogihara, Y., et al. Structural features of a wheat plastome as revealed by complete sequencing of chloroplast DNA. Mol Genet Genomics. 266 (5), 740-746 (2002).
- International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC). A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticum aestivum) genome. Science. 345 (6194), (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Bendich, A. J. Why do chloroplasts and mitochondria contain so many copies of their genome?. Bioessays. 6 (6), 279-282 (1987).
- Kumar, R. A., Oldenburg, D. J., Bendich, A. J. Changes in DNA damage, molecular integrity, and copy number for plastid DNA and mitochondrial DNA during maize development. J Exp Bot. 65 (22), 6425-6439 (2014).
- Ma, J., Li, X. Q. Organellar genome copy number variation and integrity during moderate maturation of roots and leaves of maize seedlings. Curr Genet. 61 (4), 591-600 (2015).
- Lang, E. G., et al. Simultaneous isolation of pure and intact chloroplasts and mitochondria from moss as the basis for sub-cellular proteomics. Plant Cell Rep. 30 (2), 205-215 (2011).
- Tobin, A. K. Subcellular fractionation of plant tissues. Isolation of chloroplasts and mitochondria from leaves. Methods Mol Biol. 59, 57-68 (1996).
