Yeni nesil Sıralama için Uygun Bitki Organelleri DNA Zenginleştirme Yöntemlerinin Optimizasyonu ve Karşılaştırmalı Analizi
Summary
İki bitki organelleri DNA zenginleştirme yönteminin karşılaştırılması ve optimizasyonu sunulmaktadır: geleneksel diferansiyel santrifüjleme ve metilasyon durumuna dayalı toplam gDNA'nın fraksiyonlanması. Ortaya çıkan DNA miktarını ve kalitesini değerlendirir, kısa okunmuş yeni nesil dizilemede performans gösteririz ve uzun okunan tek moleküllü dizilemede kullanım potansiyelini tartışırız.
Abstract
Bitki organelleri genomları, kompleks yapıları ve / veya alt genomik parçaları oluşturmak için eşleştirme veya rekombinasyona uğrayabilen büyük, tekrarlayan elementler içerir. Organeller genomları aynı zamanda belirli bir hücre veya doku türünün (heteroplasmi) katkı maddelerinde bulunur ve alt tiplerin bolluğu, gelişim boyunca veya stres altındayken (alt stoikometrik kayma) değişebilir. Organelar genom yapısını ve fonksiyonunu daha iyi anlamak için yeni nesil sıralama (NGS) teknolojileri gereklidir. Geleneksel sıralama çalışmaları organellar DNA elde etmek için çeşitli yöntemler kullanır: (1) Başlangıç dokusu büyük miktarda kullanılırsa, homojenize edilir ve diferansiyel santrifüjleme ve / veya degrade saflaştırma tabi tutulur. (2) Daha az miktarda doku kullanılırsa ( yani, tohum, malzeme veya alan sınırlıysa), yeterli DNA elde etmek için (1) 'de olduğu gibi aynı işlem gerçekleştirilir ve bunu takiben tam genom amplifikasyon uygulanır. (3) Biyoenformatik analiz seq için kullanılabilirToplam genomik DNA'yı ve organelar okumaları ayrıştırmak. Bütün bu yöntemlerin kendi zorlukları ve zıvanaları vardır. (1) 'te bu kadar büyük miktarda başlangıç dokusu elde etmek zor olabilir; (2) 'de, bütün genom amplifikasyonu bir sıralama ön yargı getirebilir; Ve (3) de, nükleer ve organel genomları arasındaki homoloji, toplanma ve analizi etkileyebilir. Büyük nükleer genomlara sahip bitkilerde, biyoinformatik analizler için sekanslama maliyetlerini ve sekans karmaşıklığını azaltmak için organellar DNA'yı zenginleştirmek avantajlıdır. Burada, toplam genomik DNA'yı nükleer ve organellar fraksiyonlara ayırmak için, geleneksel diferansiyel santrifüj yöntemini, adapte edilmiş bir CpG-metil açılım yaklaşımı olan dördüncü bir yöntemle karşılaştırabiliriz. Her iki yöntem de, organellar sekanslar için oldukça zenginleştirilmiş DNA olan NGS için yeterli miktarda DNA üretir; buna rağmen, mitokondriya ve kloroplastlarda farklı oranlarda bulunur. Buğday yaprak dokusu için bu yöntemlerin optimizasyonunu sunmak ve önemli avantajları tartışmak veÖrnek giriş, protokol kolaylığı ve akışaşağı uygulama bağlamında her yaklaşımın avantajları.
Introduction
Genom dizilimi, önemli bitki özelliklerinin altında yatan genetik temeli incelemek için güçlü bir araçtır. Çoğu genom dizilimi çalışması genlerin çoğunluğu çekirdekte yer aldığı için nükleer genom içeriğine odaklanır. Bununla birlikte, mitokondri (ökaryotlarda) ve plastidler (bitkilerde, özel form, kloroplast, fotosentezde çalışır) de dahil olmak üzere organellar genomları, organizmanın gelişimi, stres tepkisi ve genel uyum için gerekli olan önemli genetik bilgilere katkıda bulunur 1 . Organelar genomları nükleer genom dizilimi için toplam DNA ekstraksiyonlarında tipik olarak yer alır, ancak DNA ekstraksiyonundan önce organel sayıları azaltma yöntemleri de kullanılır 2 . Birçok çalışma, organellar genomlarını 3 , 4 , 5 ve 6 numaralı gruplara toplamak için toplam gDNA özütlemelerinden sıralama sonuçlarını kullandı.Xref "> 6 , 7. Bununla birlikte, çalışmanın amacı organellar genomlara odaklanmaktır, toplam gDNA'yı kullanmak sıralamaya ilişkin maliyetleri arttırır çünkü birçok okuma, özellikle büyük nükleer genomlara sahip bitkilerde çekirdek DNA dizileri için" kaybolur " Ayrıca, organellar sekansların nükleer genom ve organeller arasında kopyalanması ve aktarılması nedeniyle, dizileme okumalarının doğru haritalama pozisyonunu uygun genoma çevirmek bioinformatik olarak zorlayıcıdır 2 , 8. Organelar genomlarının nükleer genomdan saflaştırılması bir Bu problemleri azaltmak için strateji. Mitokondri ve kloroplastlar arasındaki homoloji bölgeleriyle eşleşen okumaları ayırmak için daha fazla biyoenformatik stratejiler kullanılabilir.
Birçok bitki türünden gelen organellar genomları sıralanırken, organellar genom çeşitliliğinin genişliği hakkında pek az şey bilinmektedirYabani popülasyonlarda veya ekili yetiştirme havuzlarında kullanılabilir. Organel genomları, aynı zamanda, tekrar sıraları 9 arasında rekombinasyon için önemli yapısal yeniden düzenlenmeye uğramayan dinamik moleküller olduğu bilinmektedir. Dahası, organellar genomun çok sayıda kopyası her bir organel içinde bulunur ve her hücrede birden fazla organel bulunur. Bu genomların tüm kopyaları aynı değildir, bu heteroplasmi olarak bilinir. Kanonik resimde aksine "ana çevrelerinde," alt-genomik daire, doğrusal kromozomlar, doğrusal konkatamerler ve dallanmış yapılar 10 de dahil olmak üzere organel genom yapılar, daha karmaşık bir görüntü için hemen giderek artan kanıtlar bulunmaktadır. Bitki organelleri genomlarının toplanması, nispeten büyük boyutları ve önemli ters çevrilmiş ve doğrudan tekrarlamalarıyla daha da karmaşıktır.
Organelar izolasyonu, DNA saflaştırması ve sonraki genom için geleneksel protokoller E dizilimi sıklıkla hantaldır ve başlangıç noktasında 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 olması gereken yüzlerce gramdan daha fazla genç yaprak dokusundan birkaç gram yukarıya kadar doku girişinin büyük miktarlarını gerektirir. Bu, doku sınırlı olduğunda organellar genom sıralamasını erişilmez hale getirir. Bazı durumlarda, tohum miktarları, nesiller bazında veya geçiş yoluyla korunması gereken erkek steril hatlarda sıralanması gerektiğinde sınırlıdır. Bu durumlarda, organellar DNA saflaştırılabilir ve sonra bütün genom amplifikasyonuna tabi tutulabilir. Bununla birlikte, bütün genom amplifikasyonu, önemli yapısal sıralama önyargılarını ortaya çıkarabilir; bu, yapısal değişiklikleri, alt-genomik yapıları ve heteroplasmi seviyelerini değerlendirirken özel bir problemdir> 18. Kısa okunan sıralama teknolojileri için kütüphane hazırlığındaki son gelişmeler, tam genom amplifikasyonundan kaçınmak için düşük giriş engellerini aşmıştır. Örneğin Illumina Nextera XT kütüphane hazırlık kiti, girdi 19 olarak kullanılmak üzere 1 ng kadar az DNA'ya izin verir. Bununla birlikte, PacBio veya Oxford Nanopore sıralama teknolojileri gibi uzun okunan sıralama uygulamaları için standart kütüphane hazırlıkları, hala organellar genom dizilimi için zorluk oluşturabilen nispeten yüksek miktarda giriş DNA'sı gerektirir. Son zamanlarda, girdi miktarlarını azaltmak ve mikrogram-DNA miktarlarının elde edilmesinin zor olduğu örneklerde genom dizilimini kolaylaştırmak için yeni ve kullanıcı tarafından yapılmış uzun okunur sıralama protokolleri geliştirildi. 20 , 21 . Ancak, bu kütüphane preparatlarına beslemek için yüksek molekül ağırlıklı, saf organellar fraksiyonlarının elde edilmesi bir sorun teşkil etmektedir.
AradıkO Tam genom amplifikasyonuna ihtiyaç duymadan NGS için uygun olan organellar DNA zenginleştirme ve izolasyon yöntemlerini karşılaştırır ve optimize eder. Özellikle, amacımız, bir yaprak alt örneği gibi sınırlı başlangıç malzemelerinden yüksek molekül ağırlıklı organellar DNA'yı zenginleştirmek için en iyi uygulamaların belirlenmesi idi. Bu çalışma, organellar DNA'yı zenginleştirmek için yöntemlerin karşılaştırmalı bir analizini sunmaktadır: (1) (2) ticari olarak mevcut bir DNA CpG-metil bağlama alanı proteini çekme yaklaşımının kullanılmasına dayanan bir DNA fraksiyonasyon protokolüne karşı (2) değiştirilmiş, geleneksel bir diferansiyel santrifüj protokolü 22 bitki dokusuna uygulanır 23 . Organel DNA'nın buğday yaprağı dokusundan izole edilmesi için, diğer bitkiler ve doku türlerine kolayca uzatılabilecek en iyi uygulamaları önermekteyiz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bugüne kadar, çoğu organellar sıralama çalışmaları, geleneksel DC yöntemleri üzerine odaklanarak spesifik DNA'yı zenginleştirir. Çeşitli bitkilerden organelleri izole etme yöntemleri tanımlanmıştır; yosun 40 ; Buğday 15 ve yulaf 11 gibi monokotlar; Ve arabidopsis 11 , ayçiçeği 17 ve kolza tohumu 14 gibi dikotlar. Çoğu protokol 13</s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Birleşik Devletler Tarım-Tarımsal Araştırma Servisi ve Ulusal Bilim Vakfı'ndan (IOS 1025881 ve IOS 1361554) fon sağlandığını kabul etmek istiyoruz. R. Caspers'a sera bakımı ve bitki bakımı için teşekkür ederiz. Ayrıca, Illumina kütüphanesi hazırlıklarının ve sıralama işlemlerinin yapıldığı Minnesota Üniversitesi Genomik Merkezi'ne teşekkür ediyoruz. Dergi editörlerinin yorumları ve el yazmalarımızı daha da güçlendiren dört anonim gözden geçiren için de minnettarız. OECD'ye, Japonya'daki meslektaşları ile ortak projeler için bu protokolleri entegre etmek için SK'ye bir burs için teşekkür ediyoruz.
Materials
| 2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME) | Sigma Aldrich | M3148-100ml | |
| 2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagent | Sigma Aldrich | I9516 | |
| agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agarose | Bio-Rad | 1613108 | |
| analytical balance | Mettler Toledo | AB54-S | |
| balance | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | B4287-25G | |
| Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8in | SPEX SamplePrep | 2183 | |
| Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 ml tubes | SPEX SamplePrep | 2664 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| ethanol, absolute | Decon Laboratories | 2716 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5M Solution, pH8.0 | Fisher | BP2482-500 | |
| gel imaging system | |||
| gel stain | Such as GelRed or Ethidium Bromide | ||
| grinding pestle, wide tip for 2 ml conical tubes | |||
| Guanidine-HCl, 8M solution | ThermoFisher | 24115 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| liquid nitrogen | |||
| Lysing enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma | L1412 | |
| Magnesium Chloride | G Bioscience | 24115 | |
| magnetic rack | ThermoFisher | A13346 | |
| microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 ml | Eppendorf | 22431021 | |
| microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 ml | Eppendorf | ||
| microcentrifuge, refrigerated | Sorvall | Legend X1R | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 ml tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 ml tubes |
| microcentrifuge, room temperature | Eppendorf | 5424 | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes |
| Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | MRCFOR100 | |
| Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnel | EMD Millipore | 475855 | |
| NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit | New England Biolabs | E2612L | |
| parafilm | Parafilm M | PM992 | |
| plastic pots and trays | |||
| polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher | BP431-100 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III) | Bio-Rad | 1703697 | |
| purification beads, Agencourt AMpureXP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | |
| Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction Kit | Qiagen | 10223 | |
| Qiagen Buffer EB (elution buffer) | Qiagen | 19086 | |
| Qiagen DNA Extraction Buffer Set | Qiagen | 19060 | |
| QiaRack | Qiagen | 19015 | |
| qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480) | Roche | ||
| qPCR plate sealing film | Roche | 4729757001 | |
| qPCR plate, 96 well plate | Roche | 4729692001 | |
| Qubit assay tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit Broad Spectrum assay kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit High Sensitivity assay kit | Life Technologies | Q32851 | |
| RNaseA | Qiagen | 19101 | |
| Serological pipettes (20 ml) and pipet-aid | Fisher | 13-678-11 | |
| Small funnels, 1 per sample | |||
| Sodium Chloride | Ambion | AM9759 | |
| Soft paintbrush, 2 per sample | |||
| SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizer | SPEX SamplePrep | Or another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced. | |
| Sucrose | Omnipure | 8550 | |
| TBE | |||
| thermomixer | |||
| Tris | Sigma | T2819-100ml | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| tube rotater | |||
| tubes, 50 mL conical polypropylene | Corning | 352070 | |
| tubes, 50 ml high-speed polypropylene | ThermoScientific/Nalgene | 3119-0050 | e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent |
| vermiculite | |||
| water bath | |||
| water, sterile and certified Nuclease-free | Fisher | 1481 | |
| water, sterile milliQ |
Referências
- Liberatore, K. L., Dukowic-Schulze, S., Miller, M. E., Chen, C., Kianian, S. F. The role of mitochondria in plant development and stress tolerance. Free Radic Biol Med. 100, 238-256 (2016).
- Samaniego Castruita, J. A., Zepeda Mendoza, M. L., Barnett, R., Wales, N., Gilbert, M. T. Odintifier–A computational method for identifying insertions of organellar origin from modern and ancient high-throughput sequencing data based on haplotype phasing. BMC Bioinformatics. 16 (232), 1-13 (2015).
- Zhang, T., Zhang, X., Hu, S., Yu, J. An efficient procedure for plant organellar genome assembly, based on whole genome data from the 454 GS FLX sequencing platform. Plant Methods. 7 (38), 1-8 (2011).
- Wambugu, P. W., Brozynska, M., Furtado, A., Waters, D. L., Henry, R. J. Relationships of wild and domesticated rices (Oryza AA genome species) based upon whole chloroplast genome sequences. Sci Rep. 5 (13957), 1-9 (2015).
- Iorizzo, M., et al. De novo assembly of the carrot mitochondrial genome using next generation sequencing of whole genomic DNA provides first evidence of DNA transfer into an angiosperm plastid genome. BMC Plant Biol. 12 (61), 1-17 (2012).
- Park, S., et al. Complete sequences of organelle genomes from the medicinal plant Rhazya stricta (Apocynaceae) and contrasting patterns of mitochondrial genome evolution across asterids. BMC Genomics. 15 (405), 1-18 (2014).
- Skippington, E., Barkman, T. J., Rice, D. W., Palmer, J. D. Miniaturized mitogenome of the parasitic plant Viscum scurruloideum is extremely divergent and dynamic and has lost all nad genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (27), E3515-E3524 (2015).
- Wicke, S., Schneeweiss, G. M., Hörandl, E., Appelhans, M. Chapter 1. Next Generation Sequencing in Plant Systematics. , (2015).
- Sloan, D. B. One ring to rule them all? Genome sequencing provides new insights into the ‘master circle’ model of plant mitochondrial DNA structure. New Phytol. 200 (4), 978-985 (2013).
- Woloszynska, M. Heteroplasmy and stoichiometric complexity of plant mitochondrial genomes–though this be madness, yet there’s method in’t. J Exp Bot. 61 (3), 657-671 (2010).
- Ahmed, Z., Fu, Y. B. An improved method with a wider applicability to isolate plant mitochondria for mtDNA extraction. Plant Methods. 11 (56), 1-11 (2015).
- Ejaz, M., et al. Comparison of small scale methods for the rapid and efficient extraction of mitochondrial DNA from wheat crop suitable for down-stream processes. Genet Mol Res. 13 (4), 10320-10331 (2014).
- Eubel, H., Heazlewood, J. L., Millar, A. H. Isolation and subfractionation of plant mitochondria for proteomic analysis. Methods Mol Biol. 355, 49-62 (2007).
- Hao, W., Fan, S., Hua, W., Wang, H. Effective extraction and assembly methods for simultaneously obtaining plastid and mitochondrial genomes. PLoS One. 9 (9), e108291 (2014).
- Pomeroy, M. K. Studies on the respiratory properties of mitochondria isolated from developing winter wheat seedlings. Plant Physiol. 53 (4), 653-657 (1974).
- Taylor, N. L., Stroher, E., Millar, A. H. Arabidopsis organelle isolation and characterization. Methods Mol Biol. 1062, 551-572 (2014).
- Triboush, S. O., Danilenko, N. G., Davydenko, O. G. A method for isolation of chloroplast DNA and mitochondrial DNA from Sunflower. Plant Mol Biol Rep. 16 (2), 183-189 (1998).
- Pinard, R., et al. Assessment of whole genome amplification-induced bias through high-throughput, massively parallel whole genome sequencing. BMC Genomics. 7 (216), 1-21 (2006).
- Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based Nextera system. BMC Biotechnol. 13 (104), 1-10 (2013).
- Raley, C., et al. Preparation of next-generation DNA sequencing libraries from ultra-low amounts of input DNA: Application to single-molecule, real-time (SMRT) sequencing on the Pacific Biosciences RS II. bioRxiv. , (2014).
- Tsai, Y. C., et al. Resolving the Complexity of Human Skin Metagenomes Using Single-Molecule Sequencing. MBio. 7 (1), e01948 (2016).
- Feehery, G. R., et al. A method for selectively enriching microbial DNA from contaminating vertebrate host DNA. PLoS One. 8 (10), e76096 (2013).
- Yigit, E., Hernandez, D. I., Trujillo, J. T., Dimalanta, E., Bailey, C. D. Genome and metagenome sequencing: Using the human methyl-binding domain to partition genomic DNA derived from plant tissues. Appl Plant Sci. 2 (11), 1-6 (2014).
- Noyszewski, A. K., et al. Accelerated evolution of the mitochondrial genome in an alloplasmic line of durum wheat. BMC Genomics. 15 (67), 1-16 (2014).
- . QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2016)
- . User developed protocol: Isolation of genomic DNA from plants and filamentous fungi using the QIAGEN Genomic-tip – (EN) Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2001)
- . QIAGEN Genomic DNA Handbook Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2012)
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Ogihara, Y., et al. Structural dynamics of cereal mitochondrial genomes as revealed by complete nucleotide sequencing of the wheat mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 33 (19), 6235-6250 (2005).
- Ogihara, Y., et al. Structural features of a wheat plastome as revealed by complete sequencing of chloroplast DNA. Mol Genet Genomics. 266 (5), 740-746 (2002).
- International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC). A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticum aestivum) genome. Science. 345 (6194), (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Bendich, A. J. Why do chloroplasts and mitochondria contain so many copies of their genome?. Bioessays. 6 (6), 279-282 (1987).
- Kumar, R. A., Oldenburg, D. J., Bendich, A. J. Changes in DNA damage, molecular integrity, and copy number for plastid DNA and mitochondrial DNA during maize development. J Exp Bot. 65 (22), 6425-6439 (2014).
- Ma, J., Li, X. Q. Organellar genome copy number variation and integrity during moderate maturation of roots and leaves of maize seedlings. Curr Genet. 61 (4), 591-600 (2015).
- Lang, E. G., et al. Simultaneous isolation of pure and intact chloroplasts and mitochondria from moss as the basis for sub-cellular proteomics. Plant Cell Rep. 30 (2), 205-215 (2011).
- Tobin, A. K. Subcellular fractionation of plant tissues. Isolation of chloroplasts and mitochondria from leaves. Methods Mol Biol. 59, 57-68 (1996).
