نموذج وينف - غير مكلفة و تراكتابل مصغر من المخاط توصيل القصبات لدراسة الأحياء الدقيقة من التهابات الرئة
Summary
إن المسالك الهوائية الموصولة بالمخاط من التليف الكيسي (سف) هي بيئة مثالية لمسببات الأمراض الميكروبية لتزدهر. تصف المخطوطة طريقة جديدة لدراسة ميكروبيوم الرئة سف في بيئة تحاكي حيث تسبب المرض وكيف أن التغيرات في الظروف الكيميائية يمكن أن تدفع الديناميات الميكروبية.
Abstract
العديد من أمراض مجرى الهواء المزمن تؤدي إلى انسداد المخاط من الشعب الهوائية. الرئتين من فرد مع التليف الكيسي هي حالة مثالية حيث القصيبات متصلة المخاط خلق الموئل مواتية للاستعمار الميكروبي. العديد من مسببات الأمراض تزدهر في هذه البيئة تتفاعل مع بعضها البعض، والقيادة العديد من الأعراض المرتبطة مرض سف. ومثل أي مجتمع ميكروبي، فإن الظروف الكيميائية لموئلها لها تأثير كبير على هيكل المجتمع ودينامياته. على سبيل المثال، الكائنات الحية الدقيقة المختلفة تزدهر في مستويات مختلفة من الأوكسجين أو غيرها من تركيزات المذاب. هذا صحيح أيضا في الرئة سف، حيث يعتقد أن تركيزات الأكسجين لدفع علم وظائف الأعضاء المجتمع وهيكل. الطرق الموصوفة هنا مصممة لتقليد بيئة الرئة وتنمو مسببات الأمراض بطريقة أكثر مماثلة لتلك التي تسبب المرض. ثم يستخدم التلاعب بالمحيط الكيميائي لهذه الميكروبات لدراسة كيفية كيميستري من التهابات الرئة يحكم البيئة الميكروبية. ويستند هذا الأسلوب، ودعا نظام وينف، على البلغم الاصطناعي وأنابيب الشعرية الضيقة التي تهدف إلى توفير التدرج الأكسجين مماثلة لتلك التي توجد في القصيبات توصيل المخاط. يسمح التعامل مع الظروف الكيميائية، مثل درجة الحموضة لوسائل الإعلام من البلغم أو ضغط المضادات الحيوية، لتصور الاختلافات الميكروبيولوجية في تلك العينات باستخدام مؤشرات ملونة، ومشاهدة لإنتاج الغاز أو بيوفيلم، أو استخراج وتسلسل محتويات الحمض النووي من كل عينة.
Introduction
وتسمى الطريقة الموصوفة في هذه المخطوطة نظام وينف 1 . الهدف العام من وينف هو توفير الإعداد التجريبية قادرة على محاكاة البيئة من الشعب الهوائية الرئة مليئة المخاط المخاط. هذا سوف يسمح لنظام قابل للدراسة لدراسة مسببات الأمراض الميكروبية من أمراض الرئة مع النمط الظاهري فرط المخاط بما في ذلك التليف الكيسي (سف)، مرض الانسداد الرئوي المزمن (كوبد)، والربو وغيرها. تم تصميم هذا الإجراء خصيصا لدراسة سف، والتي تتميز الطفرات التي تسبب إفرازات الرئة لتصبح سميكة وصعبة واضحة، في نهاية المطاف ملء القصبات وغيرها من الممرات الصغيرة مع المخاط 2 . هذا الانسداد في الرئة تمنع تبادل الغاز لأن الهواء المستنشق لم يعد قادرا على الوصول إلى العديد من الحويصلات الهوائية وأيضا توفير موطن للاستعمار الجرثومي 3 ، 4 . عدم القدرة على منع نمو الميكروبات فيالإفراط في مخاط رئة يؤدي في النهاية إلى تطور العدوى المزمنة المعقدة لمجرى الهواء. هذه المجتمعات تحتوي على مجموعة متنوعة من الكائنات الحية، بما في ذلك الفيروسات والفطريات والبكتيريا مثل الزائفة الزنجارية، وكلها تتفاعل مع بعضها البعض 5 و 6 و 7 و 8. ويعتقد أن نشاط microbiome CF الرئة أن تشارك في مشاعل الأعراض تسمى التفاقم الرئوية 1 و 9 و 10 و 11. WinCF يمكن دراسة سلوك المجتمع الميكروبي حول هذه التفاقم ويجري الآن توسيعها لتكون بمثابة نظام تجريبي قاعدة لدراسة الرئة الميكروبية البيئة. تقليديا، وقد تم دراسة التفاقم من خلال التحليل المباشر للعينات المأخوذة من الرئة. العديد من العوامل المربكة تجعل التحليل المباشر للب الميكروبيةehavior في الرئتين الصعبة، مع نظام WinCF، وكثير من هذه العوامل يتم إزالتها وسلوك microbiome الرئة يمكن دراستها بصورة مباشرة، مما يسمح للتحليل أدق النشاط الجرثومي في قصيبة-توصيل المخاط.
ويوفر النظام WinCF طريقة لتنمو وتحليل البكتيريا بطريقة يحاكي البيئة بشكل فعال الرئة. الطرق التقليدية لزراعة البكتيريا الرئة عينات زراعة في كثير من الأحيان المعنية على لوحات أجار التقليدية. هذه الأساليب تترك العينات مفتوحة للأكسجين في الغلاف الجوي، إهمال لحساب ميتة وغالبا الظروف الأكسجين الموجود في القصيبات الرئوية توصيله مع مخاط 12 و 13. زراعة على أجار تحت الظروف الهوائية شيء مثل بيئة CF الرئة ويمكن تضليل الأطباء والباحثين بشأن سلوك مسببات الأمراض التي يحاولون علاج. بالإضافة إلى ذلك، العناصر الغذائية المتاحة للبكتيريا على لوحات أجارلا يختلف عن تلك المتوفرة في البلغم الفعلي، الذي استأثرت في WinCF من خلال الاستفادة من وسائل الإعلام البلغم الاصطناعي (ASM). كما يتضح من الثقافات الزائفة في Sriramulu وآخرون. 14، ويشمل ASM مجموعة محددة من المكونات التي يحاكي الموارد المتاحة للميكروبات البلغم ويعيد التناسق البدني من البلغم أيضا. لأن الرئة المريضة لديها microbiome معين، يجب دراسة هذه الكائنات الدقيقة من الناحية المثالية أن تتم في الظروف المحددة في الرئة كذلك.
النظام WinCF يمكن تحليل سريع والتلاعب سهل من الظروف التجريبية لمراقبة التغيرات الميكروبية مماثلة إلى الكيفية التي يمكن أن تحدث في قصيبة الرئة الفعلية. هذا الأسلوب يسمح للتلقيح عدد لا يحصى من أنواع عينة ذات الصلة بما في ذلك البلغم واللعاب وغيرها من إفرازات الجسم والثقافات البكتيرية نقية أو مختلطة. طبيعة الإعداد التجريبية تسمح التفسير البصري المباشر للتم تصميم سلوك المجتمع الميكروبي ولتمكين التطبيق المصب سهل من العديد من الإجراءات الميكروبيولوجية وOMICS. مثل هذه الدراسات مهمة لتغيير تركيبة المجتمع البكتيرية بناء على الظروف الفيزيائية بيئتهم. مع WinCF الظروف الكيميائية وسائل الإعلام يمكن التلاعب بها لتحليل الآثار المترتبة على النشاط البكتيري. على سبيل المثال، الحموضة وسائل الإعلام يمكن أن تتغير قبل التلقيح مع عينة. بعد مرور فترة الحضانة، والنشاط الجرثومي في كل من هذه الشروط يمكن مقارنة مباشرة، ويمكن استخلاص استنتاجات حول كيف تتصرف البكتيريا في تلك العينات البلغم ردا على تفاوت درجة الحموضة. هنا، ونحن الخطوط العريضة لإجراءات تطبيق نظام WinCF وأمثلة لكيفية الكيمياء وسائل الاعلام يمكن التلاعب بها لدراسة الآثار المترتبة على microbiome الرئة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحتوي التركيبة الميكروبيولوجية للرئة مع سف على مجموعة كبيرة ومتنوعة من الكائنات الحية، ولكن الظروف داخل الرئة على الأرجح لها تأثير كبير على أنواع الميكروبات التي يمكن أن تعيش وتزدهر 13 ، 15 . آليات محددة من خلالها تغير هذه الظروف والآثا…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يعترفوا بجائزة فيرتكس فارماسيوتيكالز وجائزة الابتكار في مجال التليف الكيسي للتمويل R. كوين والمعاهد الوطنية للصحة / نييد لمنحة التمويل 1 U01 AI124316-01، وهو نهج بيولوجيا النظم لمعالجة مسببات الأمراض المقاومة للأدوية المتعددة. ونود أيضا أن نشكر قسم الهندسة الميكانيكية والفضاء في جامعة كاليفورنيا أوسسد في الهندسة المعمارية العليا دورة التصميم لتسهيل التعاون مع الجوانب الهندسية لهذا العمل.
Materials
| Color-Coded Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-260943 | |
| Cha-seal Tube Sealing Compound | Kimble-Chase | 43510 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma | M1778 | |
| Ferritin, cationized from horse spleen | Sigma | F7879 | |
| Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified) | AppliChem Panreac | A2159 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning cellgro | 25-025-CI | |
| MEM Amino Acids | Cellgro | 25-030-CI | |
| Egg Yolk Emulsion, 50% | Dalynn Biologicals | VE30-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P2157500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271500 | |
| 15mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-666 | |
| 50mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-656 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-150-R | |
| 2.0mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-200-C |
Referências
- Quinn, R. A., et al. A Winogradsky-based culture system shows an association between microbial fermentation and cystic fibrosis exacerbation. ISME J . 9, 1024-1038 (2015).
- Quinton, P. M. Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis. Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).
- Harrison, F. Microbial ecology of the cystic fibrosis lung. Microbiology. 153 (Pt 4), 917-923 (2007).
- Caverly, L. J., Zhao, J., LiPuma, J. J. Cystic fibrosis lung microbiome: Opportunities to reconsider management of airway infection. Pediatr pulmonol. 50, S31-S38 (2015).
- Blainey, P. C., Milla, C. E., Cornfield, D. N., Quake, S. R. Quantitative analysis of the human airway microbial ecology reveals a pervasive signature for cystic fibrosis. Sci Transl Med. 4 (153), 153ra130 (2012).
- Willner, D., et al. Spatial distribution of microbial communities in the cystic fibrosis lung. ISME J. 6 (2), 471-474 (2012).
- Delhaes, L., et al. The airway microbiota in cystic fibrosis: a complex fungal and bacterial community–implications for therapeutic management. PloS one. 7 (4), e36313 (2012).
- Rogers, G. B., et al. D. Bacterial diversity in cases of lung infection in cystic fibrosis patients: 16S ribosomal DNA (rDNA) length heterogeneity PCR and 16S rDNA terminal restriction fragment length polymorphism profiling. J clin microbiol. 41 (8), 3548-3558 (2003).
- Stenbit, A. E., Flume, P. A. Pulmonary exacerbations in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 17 (6), 442-447 (2011).
- Twomey, K. B., et al. Microbiota and metabolite profiling reveal specific alterations in bacterial community structure and environment in the cystic fibrosis airway during exacerbation. PloS one. 8 (12), e82432 (2013).
- Carmody, L. A., et al. Changes in cystic fibrosis airway microbiota at pulmonary exacerbation. Ann. Am. Thorac. Soc. 10 (3), 179-187 (2013).
- Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. J. Clin. Invest. 109 (3), 317-325 (2002).
- Cowley, E. S., Kopf, S. H., LaRiviere, A., Ziebis, W., Newman, D. K. Pediatric Cystic Fibrosis Sputum Can Be Chemically Dynamic, Anoxic, and Extremely Reduced Due to Hydrogen Sulfide Formation. mBio. 6 (4), e00767-e00715 (2015).
- Sriramulu, D. D., Lünsdorf, H., Lam, J. S., Römling, U. Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung. J. Med. Microbiol. 54 (Pt 7), 667-676 (2005).
- Quinn, R. A., et al. Biogeochemical forces shape the composition and physiology of polymicrobial communities in the cystic fibrosis lung. mBio. 5 (2), (2014).
