Dorsal Root Injection gânglio da raiz dorsal e lesão por esmagamento como um modelo para Sensorial Axon Regeneração
Summary
This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.
Abstract
Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.
Introduction
Alcançar axônio regeneração após lesão do sistema nervoso é uma tarefa desafiadora 1. Para estudar o fracasso da regeneração axonal no sistema nervoso central (CNS), os pesquisadores usaram uma infinidade de modelos de lesão do nervo. Como regiões do SNC diferentes, é importante o uso de um modelo anatomicamente apropriado para estudar a regeneração de axónios. Usando o modelo apropriado, os investigadores podem formular um tratamento específico com base na gravidade da lesão, o tipo de célula neuronal de interesse, e do tracto espinal desejado para avaliar a regeneração, em oposição a uma estratégia de tratamento "um-para-todos".
Na lesão medular, por exemplo, os sintomas mais debilitantes decorrem da perda de sensação e locomoção. Perda de sensibilidade é causada por danos aos ascendentes vias sensoriais, enquanto a perda de locomoção é causada por danos às vias motoras descendentes. Devido às diferenças celulares e anatômicas entre estes twO caminhos, muitos estudos de regeneração do axônio alvo se concentrar apenas em um ou outro caminho, com a justificativa de que a recuperação bem sucedida de qualquer um seria de grande benefício para os pacientes. Neste artigo, apresenta-se um protocolo que utiliza uma injecção directa dos gânglios da raiz dorsal (DRG) com um vector viral e uma lesão concomitante esmagamento da raiz dorsal da medula espinhal cervical inferior de um rato adulto como um modelo para estudar a regeneração axonal sensorial.
DRG neurónios sensoriais são responsáveis pela transmissão de informação sensorial, tais como sensação táctil e dor, desde a periferia até ao sistema nervoso central. As projecções longas axonal de neurónios sensoriais na medula espinal servem como um bom modelo para o estudo de longa distância a regeneração de axónios. Além disso, como os roedores pode sobreviver a uma lesão via sensorial tal como uma lesão por esmagamento da raiz dorsal com complicações mínimas de bem-estar, os investigadores podem estudar a regeneração de axónios do SNC, sem a necessidade da lesão completamente a medula espinhal. Um C5 quádruplo – C8 (l cervicalível 5-8) dorsal lesão por esmagamento raiz tem sido mostrado a ser um modelo útil para a pata dianteira desaferentação 2. Além disso, uma lesão por esmagamento dorsal raiz fornece um modelo mais "limpo" para estudar a regeneração de axónios de uma lesão da medula espinal directa porque não é complicada por outros factores, tais como a formação de cicatriz glial.
O uso da terapia de genes virais para reprogramar neurónios num estado regenerativa tem sido cada vez mais considerado como uma estratégia de tratamento promissor para muitas condições neurológicas 3. Estudos têm demonstrado a aplicação de um vector de vírus adeno-associado (AAV) transportando o transgene de uma proteína que promove o crescimento podem atingir robusto regeneração axónio com recuperação comportamental 4, 5, 6. A baixa patogenicidade aparente de AAV na indução de uma resposta imunológica e a capacidade de transduzir células que não se dividem, tais como os neurónios, fazerque o vector óptimo para a terapia genética. Além disso, a forma de AAV recombinante é utilizado para a terapia. Nesta forma, é incapaz de integrar o seu genoma viral no genoma do hospedeiro 7, reduzindo o risco de mutagénese de inserção em comparação com outros vectores virais, tais como lentivírus. Isso faz com que o AAV um cofre escolha para aplicações de terapia génica.
Como DRG contém os corpos celulares de neurónios sensoriais, é o alvo anatómica mais apropriado para a administração de vírus para a terapia de gene para o estudo e / ou promover a regeneração axonal sensorial. Num estudo comparativo de diferentes serotipos de AAV e lentivírus, AAV de serotipo 5 (AAV5) mostrou-se o mais eficiente na transdução neurios DRG ao longo de um curso de tempo de pelo menos 12 semanas quando injectado directamente no DRG 8. Além disso, o AAV pode atingir mais de 40% de eficiência de transdução, transduzir todos os subtipos neuronais de DRG, tais como a de grande diâmetro de neurofilamentos de 200 kDa(NF200) neurónios -positivas e o péptido relacionado com o gene da calcitonina de pequeno diâmetro (CGRP) – ou b4 isolectina (IB4) neurónios -positivas 4, 8.
Como o procedimento cirúrgico de DRG injeção e lesão por esmagamento da raiz dorsal é extremamente invasiva e delicada, acreditamos que este artigo vai ajudar novos usuários a aprender o procedimento de forma muito eficiente. Neste artigo, que mostra resultados representativos de ratos adultos quatro semanas após a injecção de um vus de controlo AAV5-GFP (proteína fluorescente verde) em C6 – DRGs C7 com um concomitante C5 – C8 raiz dorsal lesão por esmagamento. Este modelo é especialmente adequado para os investigadores que estão a investigar a utilização de terapia de genes virais para promover a regeneração axonal sensorial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo, é apresentado um guia de passo-a-passo para realizar uma injecção de DRG e lesão por esmagamento da raiz dorsal da medula espinhal cervical inferior de um rato adulto. Como esta é uma cirurgia extremamente invasivo e delicado, é altamente recomendável que todos os potenciais utilizadores obter treinamento e prática suficiente antes de avançar para viver a cirurgia animal. Os utilizadores devem estar familiarizado, não só com a anatomia espinal medula, mas também com os tecidos circundantes musc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por bolsas do Christopher e Dana Reeve Foundation, do Medical Research Council, a pesquisa Conselho ECMneuro Europeia, ea Cambridge NHMRC Biomedical Research Center. Nós gostaríamos de expressar nossa mais profunda gratidão a Heleen Merel van 't Spijker e Justyna Barratt para sua assistência técnica durante as filmagens. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Elizabeth Moloney e Professor Joost Verhaagen (Netherlands Institute for Neuroscience) para auxiliar na produção de AAV.
Materials
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μl) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
Referências
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
- Wu, A., Lauschke, J. L., Morris, R., Waite, P. M. Characterization of rat forepaw function in two models of cervical dorsal root injury. J Neurotrauma. 26 (1), 17-29 (2009).
- Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Hum Gene Ther. 27 (7), 478-496 (2016).
- Cheah, M., et al. Expression of an Activated Integrin Promotes Long-Distance Sensory Axon Regeneration in the Spinal Cord. J Neurosci. 36 (27), 7283-7297 (2016).
- Andrews, M. R., et al. Alpha9 integrin promotes neurite outgrowth on tenascin-C and enhances sensory axon regeneration. J Neurosci. 29 (17), 5546-5557 (2009).
- Tan, C. L., et al. Kindlin-1 enhances axon growth on inhibitory chondroitin sulfate proteoglycans and promotes sensory axon regeneration. J Neurosci. 32 (21), 7325-7335 (2012).
- McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annu Rev Genet. 38, 819-845 (2004).
- Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
- Hermens, W. T., et al. Purification of recombinant adeno-associated virus by iodixanol gradient ultracentrifugation allows rapid and reproducible preparation of vector stocks for gene transfer in the nervous system. Hum Gene Ther. 10 (11), 1885-1891 (1999).
- Kappagantula, S., et al. Neu3 sialidase-mediated ganglioside conversion is necessary for axon regeneration and is blocked in CNS axons. J Neurosci. 34 (7), 2477-2492 (2014).
- Alto, L. T., et al. Chemotropic guidance facilitates axonal regeneration and synapse formation after spinal cord injury. Nat Neurosci. 12 (9), 1106-1113 (2009).
- Bonner, J. F., et al. Grafted neural progenitors integrate and restore synaptic connectivity across the injured spinal cord. J Neurosci. 31 (12), 4675-4686 (2011).
- Wang, R., et al. Persistent restoration of sensory function by immediate or delayed systemic artemin after dorsal root injury. Nat Neurosci. 11 (4), 488-496 (2008).
- Wong, L. E., Gibson, M. E., Arnold, H. M., Pepinsky, B., Frank, E. Artemin promotes functional long-distance axonal regeneration to the brainstem after dorsal root crush. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6170-6175 (2015).
- Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Front Mol Neurosci. 8, 36 (2015).
- Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19 (1), 61-70 (2008).
- Vulchanova, L., et al. Differential adeno-associated virus mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture. Mol Pain. 6, 31 (2010).
- Gray, S. J., et al. Directed evolution of a novel adeno-associated virus (AAV) vector that crosses the seizure-compromised blood-brain barrier (BBB). Mol Ther. 18 (3), 570-578 (2010).
- Fagoe, N. D., Attwell, C. L., Kouwenhoven, D., Verhaagen, J., Mason, M. R. Overexpression of ATF3 or the combination of ATF3, c-Jun, STAT3 and Smad1 promotes regeneration of the central axon branch of sensory neurons but without synergistic effects. Hum Mol Genet. 24 (23), 6788-6800 (2015).
