This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.
Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.
Opnåelse axon regenerering efter nervesystemet skaden er en udfordrende opgave 1. For at undersøge den fejlslagne axon regeneration i centralnervesystemet (CNS) har forskere anvendt en overflod af nerve beskadigelsesmodeller. Som regioner i CNS er forskellige, er det vigtigt at anvende en anatomisk passende model til at studere axon regeneration. Ved anvendelse af passende model, kan forskerne formulere en specifik behandling baseret på sværhedsgraden af skade, den neuronale celletype af interesse, og den ønskede spinal tarmkanalen til vurdering regenerering, i modsætning til en "one-for-alle" behandlingsstrategi.
I rygmarvsskade, for eksempel de mest invaliderende symptomer stammer fra tab af følelse og bevægelse. Tab af fornemmelse er forårsaget af skader på de stigende orden sensoriske veje, mens tabet af bevægelse er forårsaget af skader på de faldende motoriske veje. På grund af cellulære og anatomiske forskelle mellem disse two veje, mange målrettede Axon restitution undersøgelser kun fokusere på den ene eller den anden vej, med formålet at vellykket genopretning af enten ville være af enorm gavn for patienterne. I denne artikel præsenterer vi en protokol, som anvender en direkte dorsalrodsganglier (DRG) injektion med en viral vektor og en samtidig dorsale knusningsbeskadigelse i den nedre cervikale rygmarv fra en voksen rotte som en model til at studere sensorisk axon regeneration.
DRG sensoriske neuroner er ansvarlig for at formidle sensorisk information, såsom taktil fornemmelse og smerte, fra periferien til CNS. De lange axonale projektioner af sensoriske neuroner i rygmarven tjene som en god model til at studere lange afstande axon regeneration. Hertil kommer, som gnavere kan overleve en sensorisk vej læsion såsom en dorsale crush skade med minimale velfærd komplikationer, kan forskerne studere CNS Axon regenerering uden behov for helt læsion rygmarven. En firedobbelt C5 – C8 (cervikal level 5-8) dorsale knusningsbeskadigelse har vist sig at være en nyttig model til forpote deafferentiering 2. Derudover en dorsale knusningsbeskadigelse tilvejebringer en "renere" model til at studere axon regeneration end en direkte rygmarvsskader, fordi den er ukompliceret af andre faktorer såsom glia ardannelse.
Anvendelsen af virale genterapi at omprogrammere neuroner i en regenerativ tilstand i stigende grad blevet betragtet som en lovende strategi behandling for mange neurologiske tilstande 3. Undersøgelser har vist anvendelsen af en adenoassocieret virus (AAV) vektor, der bærer transgenet af en vækstfremmende protein kan opnå robust axon regeneration med adfærdsmæssige genvinding 4, 5, 6. Den tilsyneladende lave patogenicitet AAV i at fremkalde et immunrespons og evnen til at transducere ikke-delende celler, såsom neuroner, gørdet den optimale vektor til genterapi. Derudover er rekombinante AAV formular til terapi. I denne form er det ude af stand til at integrere dets virale genom i værtsgenomet 7, hvilket reducerer risikoen for insertionsmutagenese sammenlignet med andre virale vektorer, såsom lentivirus. Dette gør AAV et sikkert valg for genterapianvendelser.
Som DRG indeholder cellelegemer af sensoriske neuroner, er det den mest passende anatomisk mål for virusadministration til genterapi for at studere og / eller fremme sensorisk axon regeneration. I en undersøgelse, der sammenligner forskellige AAV-serotyper og lentivirus blev AAV serotype 5 (AAV5) vist sig at være de mest effektive i transduktion DRG-neuroner over et tidsforløb på mindst 12 uger, når det injiceres direkte i DRG 8. Yderligere kan AAV opnå mere end 40% transduktionseffektivitet, transduktion alle DRG neuronale undertyper, såsom neurofilament stor diameter 200 kDa(NF200) -positive neuroner og den lille diameter calcitonin gen-relateret peptid (CGRP) – eller isolectin b4 (IB4) af positive neuroner, 4, 8.
Som den kirurgiske procedure af DRG injektion og dorsale knuse skade er ekstremt invasiv og delikat, mener vi, at denne artikel vil hjælpe nye brugere til at lære den procedure i en meget effektiv måde. I denne artikel, vi viser repræsentative resultater fra voksne rotter fire uger efter injektionen af en kontrol virus AAV5-GFP (grønt fluorescerende protein) i C6 – C7 DRG'er med en samtidig C5 – C8 dorsale knusningslæsion. Denne model er specielt velegnet til forskere, der undersøger anvendelsen af viral genterapi til at fremme sensorisk axon regeneration.
I denne artikel præsenterer vi en trin-for-trin guide til at udføre en DRG injektion og dorsale knusningsbeskadigelse i den nedre cervikale rygmarv fra en voksen rotte. Da dette er en yderst invasiv og delikat kirurgi, anbefaler vi, at alle potentielle brugere opnå tilstrækkelig uddannelse og praksis, før videre til levende dyr kirurgi. Brugerne bør være bekendt ikke kun med rygmarven anatomi, men også med de omgivende muskelvæv, vertebrale knogle struktur og kar. Ideelt set bør en kompetent bruger være i sta…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Christopher og Dana Reeve Foundation, Medical Research Council, Det Europæiske Forskningsråd ECMneuro, og Cambridge NHMRC Biomedical Research Center. Vi vil gerne udtrykke vores dybeste taknemmelighed til Heleen Merel van 't Spijker og Justyna Barratt for deres tekniske bistand under indspilningen. Vi vil gerne takke Dr. Elizabeth Moloney og professor Joost Verhaagen (Holland institut for Neurovidenskab) for at bistå i AAV produktion.
Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
Microliter Syringe RN701 (10 μl) | Hamilton | 80330 | |
Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |