Immunofluorescens Analyse af Stress Granulformation Efter Bakteriel Udfordring af Pattedyrceller
Summary
Vi beskriver en metode til den kvalitative og kvantitative analyse af spændingsgranuldannelse i pattedyrsceller, efter at cellerne er udfordret med bakterier og en række forskellige belastninger. Denne protokol kan anvendes til at undersøge det cellulære stress-granuleringsrespons i en bred vifte af værtsbakterielle interaktioner.
Abstract
Fluorescerende billeddannelse af cellulære komponenter er et effektivt redskab til at undersøge værtspatogen-interaktioner. Patogener kan påvirke mange forskellige træk ved inficerede celler, herunder organelle-ultrastruktur, cytoskeletal netværksorganisation, såvel som cellulære processer som Stress Granule (SG) formation. Karakteriseringen af, hvordan patogener undergraver værtsprocesser er en vigtig og integreret del af patogenesen. Mens variable fænotyper let kan ses, er den nøjagtige analyse af de kvalitative og kvantitative forskelle i de cellulære strukturer induceret ved patogenudfordring afgørende for at definere statistisk signifikante forskelle mellem eksperimentelle og kontrolprøver. SG-dannelse er et evolutionært konserveret stressrespons, der fører til antivirale reaktioner og er længe blevet undersøgt ved brug af virale infektioner 1 . SG-dannelse påvirker også signaleringskaskader og kan have andre stadig ukendte konseqUences 2 . Karakteriseringen af dette stressrespons til andre patogener end vira, såsom bakteriepatogener, er i øjeblikket et voksende forskningsområde 3 . For tiden er kvantitativ og kvalitativ analyse af SG-dannelsen endnu ikke rutinemæssigt anvendt, selv i virussystemerne. Her beskriver vi en simpel metode til at fremkalde og karakterisere SG-dannelse i uinficerede celler og i celler inficeret med et cytosolisk bakterielt patogen, hvilket påvirker dannelsen af SG'er som reaktion på forskellige eksogene stress. Analyse af SG dannelse og sammensætning opnås ved at anvende et antal forskellige SG markører og stedet detektor plugin i ICY, et open source image analyse værktøj.
Introduction
Visualisering af værtspatogen-interaktioner på et cellulært niveau er en stærk metode til at få indsigt i patogene strategier og til at identificere nøglecellulære veje. Faktisk kan patogener bruges som redskaber til at bestemme vigtige cellulære mål eller strukturer, da patogener har udviklet sig til at undergrave centrale cellulære processer som en strategi for deres egen overlevelse eller udbredelse. Visualisering af cellulære komponenter kan opnås ved rekombinant ekspression af fluorescensmærket hostproteiner. Selvom dette tillader realtidsanalyse, er frembringelsen af cellelinier med specifikt mærket hostproteiner yderst arbejdskrævende og kan resultere i uønskede bivirkninger. Mere praktisk er detektion af cellulære faktorer ved anvendelse af specifikke antistoffer, fordi flere værtsfaktorer kan analyseres samtidigt, og en er ikke begrænset til en bestemt celletype. En ulempe er, at kun en statisk visning kan indfanges, da immunofluorescensanalyse nødvendiggør værtscellefixation. Imidlertid er en vigtig fordel ved immunofluorescensbilleddannelse, at den let udmærker sig til både kvalitativ og kvantitativ analyse. Dette kan igen bruges til at opnå statistisk signifikante forskelle for at give nye indsigter i værtspatogeninteraktioner.
Fluorescerende billedanalyseprogrammer er kraftfulde analytiske værktøjer til udførelse af 3D- og 4D-analyse. Men de høje omkostninger ved software og vedligeholdelse gør metoder baseret på fri open source-software mere generelt attraktiv. Omhyggelig billedanalyse ved hjælp af bioanalysesoftware er værdifuld, da den understøtter visuel analyse og ved tildeling af statistiske signifikanser øger tilliden til korrektiteten af en given fænotype. Tidligere er SG'er blevet analyseret ved hjælp af den gratis ImageJ-software, som nødvendiggør den manuelle identifikation af individuelle SG'er 4 . Her tilvejebringer vi en protokol til induktion og analyse af cellulær SG-dannelse i sammenhæng med bacTerielle infektioner ved hjælp af den gratis open source bio-image analyse software ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). Bio-image analyse software har et indbygget spot detektor program, der er yderst velegnet til SG analyse. Det gør det muligt at finjustere den automatiserede detekteringsproces i bestemte interesserede interesser (ROI'er). Dette overvinder behovet for manuel analyse af individuelle SG'er og fjerner prøveudtagning.
Mange miljøbelastninger fremkalder dannelsen af SG'er, som er fasetætte cytosoliske, ikke-membranøse strukturer på 0,2 – 5 μm i diameter 5 , 6 . Denne cellulære respons bevares evolutionært i gær, planter og pattedyr og opstår, når global proteinoversættelse er hæmmet. Det indebærer aggregering af stablede translationsinitieringskomplekser i SG'er, der betragtes som holdingssteder for translationelt inaktive mRNA'er, hvilket tillader selektiv translation af en delmængde af cellulære mRNA'er.Efter fjernelse af stress opløses SG'er og globale hastigheder for proteinsyntese genoptages. SG'er er sammensat af translationsforlængelsesinitieringsfaktorer, proteiner involveret i RNA-metabolisme, RNA-bindende proteiner, såvel som stilladsproteiner og faktorer involveret i værtscellesignalering 2 , skønt den nøjagtige sammensætning kan variere afhængigt af den påførte belastning. Miljøfaktorer, som fremkalder SG-dannelse, omfatter aminosyre sult, UV-bestråling, varmeskok, osmotisk shock, endoplasmatisk retikulumspænding, hypoxi og viral infektion 2 , 7 , 8 . Der er gjort store fremskridt med at forstå, hvordan vira inducerer og undergraver også SG-dannelse, mens der endnu ikke er meget kendt, hvordan andre patogener, såsom bakterielle, svampe- eller protozoanpatogener, påvirker dette cellulære stressrespons 1 , 7 .
ShigeLla flexneri er et gram-negativt fakultativt cytosolisk patogen hos mennesker og det forårsagende middel til svær diarré eller shigellose. Shigellose er en stor folkesundhedsbyrde og fører til 28.000 dødsfald årligt hos børn under 5 år 9 , 10 år . S. flexneri inficerer colonepitelet og spredes celle-til-celle ved at kapre værtens cytoskeletalkomponenter 11 , 12 . Infektion af epitelet understøtter replikationen af S. flexneri inden for cytosolen, men inficerede makrofager dør gennem en inflammatorisk celledødsproces kaldet pyroptose. Infektion fører til en massiv rekruttering af neutrofiler og svær inflammation, der ledsages af varme, oxidativ stress og ødelæggelse af væv. Således, mens inficerede celler er underkastet interne spændinger induceret af infektion, såsom Golgi-afbrydelse, genotoksisk stress og cytoskeletisk omlejringS, inficerede celler er også udsat for miljøbelastninger på grund af den inflammatoriske proces.
Karakterisering af effekten af S. flexneri infektion på cellernes evne til at reagere på miljøbelastninger ved anvendelse af et antal SG markører har vist, at infektion fører til kvalitative og kvantitative forskelle i SG-sammensætning 3 . Imidlertid er lille kendt om andre bakterielle patogener. Her beskriver vi en metode til infektion af værtsceller med cytosolisk patogen S. flexneri , stress af celler med forskellige miljøbelastninger, mærkning af SG-komponenter og den kvalitative og kvantitative analyse af SG-dannelse og sammensætning i forbindelse med inficerede Og ikke-inficerede celler. Denne metode er meget anvendelig for andre bakterielle patogener. Derudover kan billedanalysen af SG-dannelsen anvendes til infektioner af virus eller andre patogener. Det kan bruges til at analysere SGDannelse ved infektion eller effekten af infektion på SG-dannelse som reaktion på eksogene stress.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen skitseret her beskriver induktion, lokalisering og analyse af SG'er i ikke-inficerede celler og celler inficeret med cytosolisk patogen S. flexneri i nærvær eller fravær af eksogen stress. Ved hjælp af gratis billedsoftware tillader protokollerne den præcise kvalitative og kvantitative analyse af SG-dannelsen til at identificere og statistisk adressere forskelle i givne fænotyper.
Der er flere kritiske trin inden for protokollen til infektionen, SG-induktion og…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PS er modtager af Bill og Melinda Gates Grand Challenge Grant OPP1141322. PV blev støttet af et schweizisk National Science Foundation Early Postdoc Mobility fellesskap og et Roux-Cantarini postdoktoralt fællesskab. PJS understøttes af et HHMI-tilskud og ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.
Materials
| Primary Antibodies | |||
| eIF3b (N20), origin goat | Santa Cruz | sc-16377 | Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1 in 300 |
| eIF3b (A20), origin goat | Santa Cruz | sc-16378 | Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1 in 300 |
| eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) | Cell Signaling | 3411 | Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1 in 800 |
| eIF4AI, origin goat | Santa Cruz | sc-14211 | Recommended by (Ref # 13). Dilution 1 in 200 |
| eIF4B, origin rabbit | Abcam | ab186856 | Good stress granule marker in our hands. Dilution 1 in 300 |
| eIF4B, origin rabbit | Cell Signaling | 3592 | Recommended by Ref # 13. Dilution 1 in 100 |
| eIF4G, origin rabbit | Santa Cruz | sc-11373 | Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1 in 300 |
| G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) | BD Biosciences | 611126 | Widely used SG marker. Dilution 1 in 300 |
| Tia-1, origin goat | Santa Cruz | sc-1751 | Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1 in 300 |
| Alexa-conjugated Secondary Antibodies | |||
| A488 anti-goat , origin donkey | Thermo Fisher | A-11055 | Cross absorbed. Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-goat, origin donkey | Thermo Fisher | A-11057 | Cross absorbed. Dilution 1 in 500 |
| A488 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A-21202 | Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A10037 | Dilution 1 in 500 |
| A647 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A31571 | Dilution 1 in 500 |
| A488 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A-21206 | Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A10042 | Dilution 1 in 500 |
| Other Reagents | |||
| Shigella flexneri | Available from various laboratories by request | ||
| Tryptone Casein Soya (TCS) broth | BD Biosciences | 211825 | Standard growth medium for Shigella, application – bacterial growth |
| TCS agar | BD Biosciences | 236950 | Standard growth agar for Shigella, application – bacterial growth |
| Congo red | SERVA Electrophoresis GmbH | 27215.01 | Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application – bacterial growth |
| Poly L lysine | Sigma-Aldrich | P1274 | Useful to coating bacteria to increase infection, application – infection |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application – infection |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | PH buffer useful when cells are incubated at room-temperature, application – cell culture |
| DMEM | Life Technologies | 31885 | Standard culture medium for HeLa cells, application – cell culture |
| Fetal calf serum | Biowest | S1810-100 | 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application – cell culture |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | 1/100 dilution used for HeLa cell culture medium, application – cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Reagent diluent, application – cell culture |
| Sodium arsenite | Sigma-Aldrich | S7400 | Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application – stress inducer |
| Clotrimazole | Sigma-Aldrich | C6019 | Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application – stress inducer |
| PFA | Electron Microscopy Scences | 15714 | 4% PFA is used for standard fixation of cells, application – fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application – permeabilization |
| A647-phalloidin | Thermo Fisher | A22287 | Dilution is at 1/40, best added during 2ary antibody staining, application – staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application – staining |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | BR701501 | Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application – staining |
| Prolong Gold | Thermo Fisher | 36930 | Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application – mounting |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting |
| 24-well cell culture plate | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Standard tissue culture plates, application – cell culture |
| 12-mm glass coverslips | NeuVitro | 1001/12 | Cell culture support for immunofluorescent applications, application – cell support |
| forceps | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and obust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting |
| Programs and Equipment | |||
| Prism | GraphPad Software | Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application – data analysis | |
| Leica SP5 | Leica Microsystems | Confocal microsope, application – image acquisition | |
| Imaris | Bitplane | Professional image analysis program, application – data analysis | |
| Excel | Microsoft | Data analysis and graphing program, application – data analysis | |
Referências
- Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436 (2), 255-267 (2013).
- Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
- Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -. X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation. Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).
- Kolobova, E., Efimov, A., et al. Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules. Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).
- Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
- Anderson, P., Kedersha, N. Stressful initiations. J Cell Sci. 115, 3227-3234 (2002).
- Mohr, I., Sonenberg, N. Host translation at the nexus of infection and immunity. Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).
- Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor. Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).
- Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
- Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children. PloS One. 8 (9), 72788 (2013).
- Ashida, H., Ogawa, M., et al. Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses. Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).
- Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).
- Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).
