Summary

स्तनधारी कोशिकाओं की जीवाणु चैलेंज के बाद तनाव ग्रेन्युल संरचना का इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण

Published: July 03, 2017
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Summary

हम स्तनधारी कोशिकाओं में तनाव ग्रेन्युल गठन के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं, जब कोशिकाओं को बैक्टीरिया से चुनौती दी जाती है और कई अलग-अलग तनाव होते हैं। मेजबान बैक्टीरियल इंटरैक्शन की एक विस्तृत श्रृंखला में सेलुलर तनाव ग्रेन्युल प्रतिक्रिया की जांच के लिए यह प्रोटोकॉल लागू किया जा सकता है।

Abstract

सेलुलर घटकों के फ्लोरोसेंट इमेजिंग मेजबान-रोगज़नक़ बातचीत के लिए एक प्रभावी उपकरण है। रोगजनक संक्रमित कोशिकाओं के कई अलग-अलग विशेषताओं को प्रभावित कर सकते हैं, जिसमें इनेगल मूलभूत संरचना, साइटोस्केलेटल नेटवर्क संगठन, साथ ही साथ स्ट्रेस ग्रेन्युल (एसजी) गठन जैसी सेलुलर प्रक्रियाएं शामिल हैं। रोगज़नक़ों को कैसे व्यवस्थित करने की प्रक्रियाओं का लक्षण वर्णन रोगजनन के क्षेत्र का एक महत्वपूर्ण और अभिन्न अंग है। चर चरमांत्र आसानी से दिखाई दे सकते हैं, जबकि प्रयोगात्मक और नियंत्रण नमूनों के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर को परिभाषित करने के लिए रोगजनन चुनौती से प्रेरित सेलुलर संरचनाओं में गुणात्मक और मात्रात्मक अंतर का सटीक विश्लेषण आवश्यक है। एसजी का गठन एक विकासशील संरक्षित तनाव प्रतिक्रिया है जो एंटीवायरल प्रतिक्रियाओं की ओर जाता है और वायरल संक्रमण 1 का उपयोग करके लंबे समय तक जांच की जाती है। एसजी निर्माण सिग्नलिंग कैसकेड को प्रभावित करता है और अन्य अभी भी अज्ञात पवित्रा हो सकता हैयून्स 2 वायरस के अलावा इस तरह के बैक्टीरियल रोगजनकों के अलावा रोगजनकों के लिए इस तनाव प्रतिक्रिया की विशेषता, वर्तमान में अनुसंधान 3 का उभरते क्षेत्र है। अभी के लिए, एसजी के गठन का मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण अभी तक नियमित रूप से इस्तेमाल नहीं किया गया है, यहां तक ​​कि वायरल सिस्टम में भी। यहाँ हम असिंकित कोशिकाओं में एसजी के गठन और उत्प्रेरित करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन करते हैं और एक साइटोस्लिक बैक्टीरियल रोगजन से संक्रमित कोशिकाओं में, जो विभिन्न बहिर्जात तनाव के जवाब में एसजीओं के गठन को प्रभावित करता है। एसजी के गठन और संरचना का विश्लेषण कई एसजी मार्करों और आईसीवाई के स्पॉट डिटेक्टर प्लग-इन का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है, एक ओपन सोर्स इमेज विश्लेषण टूल।

Introduction

सेलुलर स्तर पर होस्ट-पाथोजेन इंटरैक्शन विज़ुअलाइज़ करना रोगजनक रणनीतियों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने और प्रमुख सेलुलर मार्गों की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। दरअसल, महत्वपूर्ण सेलुलर लक्ष्यों या संरचनाओं को हल करने के लिए रोगजनकों को उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि रोगजनकों ने केंद्रीय सेलुलर प्रक्रियाओं को अपने अस्तित्व या प्रसार के लिए एक रणनीति के रूप में नष्ट करने के लिए विकसित किया है। सेलुलर घटकों के विज़ुअलाइज़ेशन को पुन: संयोजन से फ्लोरोसेंटली टैग किए गए होस्ट प्रोटीन को व्यक्त करते हुए प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि यह वास्तविक समय विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, विशेष रूप से टैग की मेजबानी प्रोटीन के साथ सेल लाइनों की पीढ़ी अत्यधिक श्रमसाध्य है और नतीजतन दुष्प्रभाव हो सकता है। अधिक सुविधाजनक, विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए सेलुलर कारकों का पता लगाना है, क्योंकि एक साथ कई होस्ट कारकों का विश्लेषण किया जा सकता है और एक विशेष सेल प्रकार तक सीमित नहीं है। एक दोष यह है कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के रूप में केवल एक स्थिर दृश्य को कैप्चर किया जा सकता है, मेजबान सेल फिक्सट आवश्यक हैआयन। हालांकि, इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह आसानी से गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण दोनों के लिए उधार देता है इसके बदले में मेजबान-रोगज़नक बातचीत में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

फ्लोरोसेंट इमेज विश्लेषण प्रोग्राम 3 डी और 4 डी विश्लेषण करने के लिए शक्तिशाली विश्लेषणात्मक टूल हैं। हालांकि, सॉफ्टवेयर की उच्च लागत और इसके रखरखाव मुक्त खुले स्रोत सॉफ़्टवेयर के आधार पर तरीकों को अधिक व्यापक रूप से आकर्षक बनाते हैं। जैव-विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सावधानी से इमेज विश्लेषण मूल्यवान है क्योंकि यह दृश्य विश्लेषण को सिद्ध करता है और, जब सांख्यिकीय महत्व देते हैं, तो किसी दिए गए फेनोटाइप की शुद्धता में विश्वास बढ़ता है। पहले, एसजीएस का उपयोग मुफ्त ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके किया गया है, जो व्यक्तिगत एसजीएस 4 की मैन्युअल पहचान की आवश्यकता है। यहां हम बीएसी के संदर्भ में सेलुलर एसजी गठन के प्रेरण और विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैंफ्री ओपन सोर्स जैव-इमेज विश्लेषण सॉफ्टवेयर आईसीवाई (http://icy.bioimageanalysis.org) का उपयोग करते हुए भयानक संक्रमण। बायो-इमेज विश्लेषण सॉफ्टवेयर का एक अंतर्निहित स्पॉट डिटेक्टर प्रोग्राम है जो एसजी विश्लेषण के लिए बेहद उपयुक्त है। यह ब्याज निर्दिष्ट क्षेत्रों (आरओआई) में स्वचालित पहचान प्रक्रिया के ठीक-ठीक होने की अनुमति देता है। यह व्यक्तिगत एसजीएस के मैनुअल विश्लेषण की आवश्यकता पर नज़र रखता है और नमूनाकरण पूर्वाग्रह को निकालता है।

कई पर्यावरणीय तनाव एसजीओं के गठन को प्रेरित करते हैं, जो चरण घने साइटोसॉलिक, व्याकरण 5 , 6 में 0.2-5 माइक्रोन के गैर-झिल्लीदार संरचनाएं हैं। यह सेलुलर प्रतिक्रिया खमीर, पौधों और स्तनधारियों में विकसित होती है और तब होती है जब वैश्विक प्रोटीन अनुवाद को हिचकते हैं। इसमें एसजीएस में स्थगित अनुवाद दीक्षा परिसरों का एकत्रीकरण शामिल है, जो कि अनुवादित रूप से निष्क्रिय एमआरएनए के लिए जगहों को माना जाता है, सेलुलर एमआरएनए के एक उपसंचर के चयनात्मक अनुवाद की अनुमति देता है।तनाव को हटाने पर, एसजीओं को भंग किया जाता है और प्रोटीन संश्लेषण की वैश्विक दरों को फिर से शुरू होता है। एसजीएस अनुवाद विस्तार प्रवर्तन कारक, आरएनए चयापचय में शामिल प्रोटीन, आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन, साथ ही मचान प्रोटीन और मेजबान सेल सिग्नलिंग में शामिल कारक हैं, हालांकि सटीक संरचना लागू होने वाले तनाव के आधार पर भिन्न हो सकती है। एसजी के गठन के लिए प्रेरित पर्यावरण कारकों में एमिनो एसिड भूख, यूवी विकिरण, गर्मी झटका, आसमाटिक सदमे, एंडोप्लास्मिक रेटिकुलम तनाव, हाइपॉक्सिया और वायरल संक्रमण 2 , 7 , 8 शामिल हैं । बहुत प्रगति को समझने में किया गया है कि वायरस कैसे प्रेरित करते हैं और एसजी के गठन को भी नष्ट करते हैं, जबकि अभी तक यह जान लिया जाता है कि बैक्टेरिया, कवक या प्रोटोजोअन रोगजनकों जैसे अन्य रोगजनकों के इस सेलुलर तनाव प्रतिक्रिया 1 , 7 को कैसे प्रभावित करते हैं।

Shigeएलएलए फ्लेन्क्निरी एक ग्राम-नकारात्मक प्रायोगिक साइटोसोलिक रोगज़नक़ा है और गंभीर दस्त या शिगलोसिस के प्रेरक एजेंट हैं। शिगेलोसिस एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य बोझ है और 5 साल की उम्र के 9 , 10 के तहत बच्चों में सालाना 28,000 मौतें होती हैं। एस फ्लेक्सनेरी कोलोनीक एपिथेलियम को संक्रमित करता है और मेजबान के साइटोकेकेलेटल घटकों 11 , 12 को अपहृत करके सेल-टू-सेल फैलता है। एपिथेलियम का संक्रमण साइटोकस के भीतर एस । फ्लेन्क्लेरी की प्रतिकृति का समर्थन करता है, लेकिन संक्रमित मैक्रोफेज पाइप्रोसिस नामक एक भड़काऊ कोशिका मृत्यु प्रक्रिया के माध्यम से मर जाते हैं। संक्रमण न्युट्रोफिल की भारी भर्ती और गर्मी, ऑक्सीडेटिव तनाव और ऊतक विनाश के साथ गंभीर सूजन की ओर जाता है। इस प्रकार, जबकि संक्रमित कोशिकाओं को संक्रमण से प्रेरित आंतरिक तनाव के अधीन होते हैं, जैसे गोल्गी विघटन, जीनोटॉक्सिक तनाव और साइटोस्केलेटल पुनर्व्यवस्थाएस, संक्रमित कोशिकाओं को भी भड़काऊ प्रक्रिया के कारण पर्यावरण तनाव के अधीन हैं

कई एसजी मार्करों का उपयोग करते हुए पर्यावरणीय तनाव पर प्रतिक्रिया करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता पर एस फ्लेन्डेरई संक्रमण के प्रभाव का लक्षण दिखाता है कि संक्रमण एसजी संरचना 3 में गुणात्मक और मात्रात्मक अंतर को दर्शाता है। हालांकि, अन्य बैक्टीरियल रोगजनकों के बारे में बहुत कम जानकारी है यहां हम साइटोसोलिक रोगज़न एस। फ्लेन्डेरी के साथ मेजबान कोशिकाओं के संक्रमण के लिए एक पद्धति का वर्णन करते हैं, विभिन्न पर्यावरणीय तनावों के साथ कोशिकाओं पर जोर देते हैं, एसजी घटकों के लेबलिंग और संक्रमित के संदर्भ में एसजी के गठन और संरचना का गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण और गैर-संक्रमित कोशिकाएं यह विधि व्यापक रूप से अन्य बैक्टीरियल रोगजनकों पर लागू होती है। इसके अलावा, एसजी के गठन का चित्र विश्लेषण वायरस या अन्य रोगजनकों द्वारा संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह एसजी का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैबहिष्कार तनाव के जवाब में एसजी के गठन पर संक्रमण या संक्रमण के प्रभाव पर प्रभाव।

Protocol

1. बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं की तैयारी 12 या 14 मिमी का ग्लास आवरण स्थानांतरण, या तो 24- या 12-अच्छी तरह प्लेटें, क्रमशः बाँझ चिमटी के साथ, एक प्रयोगात्मक स्थिति में एक अच्छी तरह से गिना जाता है। इन्हें 1…

Representative Results

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल को समझाने और प्रदर्शित करने के लिए, हमने सीओटीओएसओलिक रोगज़न एस। फ्लेन्नेरी के साथ संक्रमित हेला कोशिकाओं में क्लॉटियमजाइल प्रेरित एसजीएस की छवि क?…

Discussion

यहां बताया गया प्रोटोकॉल गैर-संक्रमित कोशिकाओं और एसोसिएट्स के एसोसिएशन का विश्लेषण, साइटोसोलिक रोगज़न एस एस फ्लेन्डेरी से उत्पन्न होता है जो बाह्य तनाव की मौजूदगी या अनुपस्थिति में होता है। मुक…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

पी एस बिल और मेलिंडा गेट्स ग्रैंड चैलेंज अनुदान OPP1141322 के एक प्राप्तकर्ता है पीवी को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन के प्रारंभिक पोस्टडॉक मोबिलिटी फेलोशिप और रौक्स-कैंटरीनी पोस्टडॉक्टरल फेलोशिप का समर्थन किया गया था। पीजेएस एचएचएमआई अनुदान और ईआरसी -2013-एडीजी 339579-डिक्रिप्ट द्वारा समर्थित है।

Materials

Primary Antibodies
eIF3b (N20), origin goat Santa Cruz sc-16377 Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1 in 300
eIF3b (A20), origin goat Santa Cruz sc-16378 Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1 in 300
eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) Cell Signaling 3411 Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1 in 800
eIF4AI, origin goat Santa Cruz sc-14211 Recommended by (Ref # 13). Dilution 1 in 200
eIF4B, origin rabbit Abcam ab186856 Good stress granule marker in our hands. Dilution 1 in 300
eIF4B, origin rabbit Cell Signaling 3592 Recommended by Ref # 13. Dilution 1 in 100
eIF4G, origin rabbit Santa Cruz sc-11373 Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1 in 300
G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) BD Biosciences 611126 Widely used SG marker. Dilution 1 in 300
Tia-1, origin goat Santa Cruz sc-1751 Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1 in 300
Alexa-conjugated Secondary Antibodies
A488 anti-goat , origin donkey Thermo Fisher A-11055 Cross absorbed. Dilution 1 in 500
A568 anti-goat, origin donkey Thermo Fisher A-11057 Cross absorbed. Dilution 1 in 500
A488 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A-21202 Dilution 1 in 500
A568 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A10037 Dilution 1 in 500
A647 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A31571 Dilution 1 in 500
A488 anti-rabbit, origin donkey Thermo Fisher A-21206 Dilution 1 in 500
A568 anti-rabbit, origin donkey Thermo Fisher A10042 Dilution 1 in 500
Other Reagents
Shigella flexneri Available from various laboratories by request
Tryptone Casein Soya (TCS) broth BD Biosciences 211825 Standard growth medium for Shigella, application – bacterial growth
TCS agar BD Biosciences 236950 Standard growth agar for Shigella, application – bacterial growth
Congo red SERVA Electrophoresis GmbH 27215.01 Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application – bacterial growth
Poly L lysine Sigma-Aldrich P1274 Useful to coating bacteria to increase infection, application – infection
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397 Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application – infection
HEPES Life Technologies 15630-056 PH buffer useful when cells are incubated at room-temperature, application – cell culture
DMEM Life Technologies 31885 Standard culture medium for HeLa cells, application – cell culture
Fetal calf serum Biowest S1810-100 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application – cell culture
Non-essential amino acids Life Technologies 11140 1/100 dilution used for HeLa cell culture medium, application – cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D2650 Reagent diluent, application – cell culture
Sodium arsenite Sigma-Aldrich S7400 Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application – stress inducer
Clotrimazole Sigma-Aldrich C6019 Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application – stress inducer
PFA Electron Microscopy Scences 15714 4% PFA is used for standard fixation of cells, application – fixation
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application – permeabilization
A647-phalloidin Thermo Fisher A22287 Dilution is at 1/40, best added during 2ary antibody staining, application – staining
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application – staining
Parafilm Sigma-Aldrich BR701501 Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application – staining
Prolong Gold Thermo Fisher 36930 Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application – mounting
Mowiol Sigma-Aldrich 81381 Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting
24-well cell culture plate Sigma-Aldrich CLS3527 Standard tissue culture plates, application – cell culture
12-mm glass coverslips NeuVitro 1001/12 Cell culture support for immunofluorescent applications, application – cell support
forceps Sigma-Aldrich 81381 Cheap and obust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting
Programs and Equipment
Prism GraphPad Software Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application – data analysis
Leica SP5 Leica Microsystems Confocal microsope, application – image acquisition
Imaris Bitplane Professional image analysis program, application – data analysis
Excel Microsoft Data analysis and graphing program, application – data analysis

Referências

  1. Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436 (2), 255-267 (2013).
  2. Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
  3. Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -. X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation. Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).
  4. Kolobova, E., Efimov, A., et al. Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules. Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).
  5. Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
  6. Anderson, P., Kedersha, N. Stressful initiations. J Cell Sci. 115, 3227-3234 (2002).
  7. Mohr, I., Sonenberg, N. Host translation at the nexus of infection and immunity. Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).
  8. Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor. Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).
  9. Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
  10. Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children. PloS One. 8 (9), 72788 (2013).
  11. Ashida, H., Ogawa, M., et al. Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses. Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).
  12. Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).
  13. Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
  14. Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).
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Citar este artigo
Vonaesch, P., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (125), e55536, doi:10.3791/55536 (2017).

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