हम स्तनधारी कोशिकाओं में तनाव ग्रेन्युल गठन के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं, जब कोशिकाओं को बैक्टीरिया से चुनौती दी जाती है और कई अलग-अलग तनाव होते हैं। मेजबान बैक्टीरियल इंटरैक्शन की एक विस्तृत श्रृंखला में सेलुलर तनाव ग्रेन्युल प्रतिक्रिया की जांच के लिए यह प्रोटोकॉल लागू किया जा सकता है।
सेलुलर घटकों के फ्लोरोसेंट इमेजिंग मेजबान-रोगज़नक़ बातचीत के लिए एक प्रभावी उपकरण है। रोगजनक संक्रमित कोशिकाओं के कई अलग-अलग विशेषताओं को प्रभावित कर सकते हैं, जिसमें इनेगल मूलभूत संरचना, साइटोस्केलेटल नेटवर्क संगठन, साथ ही साथ स्ट्रेस ग्रेन्युल (एसजी) गठन जैसी सेलुलर प्रक्रियाएं शामिल हैं। रोगज़नक़ों को कैसे व्यवस्थित करने की प्रक्रियाओं का लक्षण वर्णन रोगजनन के क्षेत्र का एक महत्वपूर्ण और अभिन्न अंग है। चर चरमांत्र आसानी से दिखाई दे सकते हैं, जबकि प्रयोगात्मक और नियंत्रण नमूनों के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर को परिभाषित करने के लिए रोगजनन चुनौती से प्रेरित सेलुलर संरचनाओं में गुणात्मक और मात्रात्मक अंतर का सटीक विश्लेषण आवश्यक है। एसजी का गठन एक विकासशील संरक्षित तनाव प्रतिक्रिया है जो एंटीवायरल प्रतिक्रियाओं की ओर जाता है और वायरल संक्रमण 1 का उपयोग करके लंबे समय तक जांच की जाती है। एसजी निर्माण सिग्नलिंग कैसकेड को प्रभावित करता है और अन्य अभी भी अज्ञात पवित्रा हो सकता हैयून्स 2 वायरस के अलावा इस तरह के बैक्टीरियल रोगजनकों के अलावा रोगजनकों के लिए इस तनाव प्रतिक्रिया की विशेषता, वर्तमान में अनुसंधान 3 का उभरते क्षेत्र है। अभी के लिए, एसजी के गठन का मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण अभी तक नियमित रूप से इस्तेमाल नहीं किया गया है, यहां तक कि वायरल सिस्टम में भी। यहाँ हम असिंकित कोशिकाओं में एसजी के गठन और उत्प्रेरित करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन करते हैं और एक साइटोस्लिक बैक्टीरियल रोगजन से संक्रमित कोशिकाओं में, जो विभिन्न बहिर्जात तनाव के जवाब में एसजीओं के गठन को प्रभावित करता है। एसजी के गठन और संरचना का विश्लेषण कई एसजी मार्करों और आईसीवाई के स्पॉट डिटेक्टर प्लग-इन का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है, एक ओपन सोर्स इमेज विश्लेषण टूल।
सेलुलर स्तर पर होस्ट-पाथोजेन इंटरैक्शन विज़ुअलाइज़ करना रोगजनक रणनीतियों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने और प्रमुख सेलुलर मार्गों की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। दरअसल, महत्वपूर्ण सेलुलर लक्ष्यों या संरचनाओं को हल करने के लिए रोगजनकों को उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि रोगजनकों ने केंद्रीय सेलुलर प्रक्रियाओं को अपने अस्तित्व या प्रसार के लिए एक रणनीति के रूप में नष्ट करने के लिए विकसित किया है। सेलुलर घटकों के विज़ुअलाइज़ेशन को पुन: संयोजन से फ्लोरोसेंटली टैग किए गए होस्ट प्रोटीन को व्यक्त करते हुए प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि यह वास्तविक समय विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, विशेष रूप से टैग की मेजबानी प्रोटीन के साथ सेल लाइनों की पीढ़ी अत्यधिक श्रमसाध्य है और नतीजतन दुष्प्रभाव हो सकता है। अधिक सुविधाजनक, विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए सेलुलर कारकों का पता लगाना है, क्योंकि एक साथ कई होस्ट कारकों का विश्लेषण किया जा सकता है और एक विशेष सेल प्रकार तक सीमित नहीं है। एक दोष यह है कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के रूप में केवल एक स्थिर दृश्य को कैप्चर किया जा सकता है, मेजबान सेल फिक्सट आवश्यक हैआयन। हालांकि, इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह आसानी से गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण दोनों के लिए उधार देता है इसके बदले में मेजबान-रोगज़नक बातचीत में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।
फ्लोरोसेंट इमेज विश्लेषण प्रोग्राम 3 डी और 4 डी विश्लेषण करने के लिए शक्तिशाली विश्लेषणात्मक टूल हैं। हालांकि, सॉफ्टवेयर की उच्च लागत और इसके रखरखाव मुक्त खुले स्रोत सॉफ़्टवेयर के आधार पर तरीकों को अधिक व्यापक रूप से आकर्षक बनाते हैं। जैव-विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सावधानी से इमेज विश्लेषण मूल्यवान है क्योंकि यह दृश्य विश्लेषण को सिद्ध करता है और, जब सांख्यिकीय महत्व देते हैं, तो किसी दिए गए फेनोटाइप की शुद्धता में विश्वास बढ़ता है। पहले, एसजीएस का उपयोग मुफ्त ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके किया गया है, जो व्यक्तिगत एसजीएस 4 की मैन्युअल पहचान की आवश्यकता है। यहां हम बीएसी के संदर्भ में सेलुलर एसजी गठन के प्रेरण और विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैंफ्री ओपन सोर्स जैव-इमेज विश्लेषण सॉफ्टवेयर आईसीवाई (http://icy.bioimageanalysis.org) का उपयोग करते हुए भयानक संक्रमण। बायो-इमेज विश्लेषण सॉफ्टवेयर का एक अंतर्निहित स्पॉट डिटेक्टर प्रोग्राम है जो एसजी विश्लेषण के लिए बेहद उपयुक्त है। यह ब्याज निर्दिष्ट क्षेत्रों (आरओआई) में स्वचालित पहचान प्रक्रिया के ठीक-ठीक होने की अनुमति देता है। यह व्यक्तिगत एसजीएस के मैनुअल विश्लेषण की आवश्यकता पर नज़र रखता है और नमूनाकरण पूर्वाग्रह को निकालता है।
कई पर्यावरणीय तनाव एसजीओं के गठन को प्रेरित करते हैं, जो चरण घने साइटोसॉलिक, व्याकरण 5 , 6 में 0.2-5 माइक्रोन के गैर-झिल्लीदार संरचनाएं हैं। यह सेलुलर प्रतिक्रिया खमीर, पौधों और स्तनधारियों में विकसित होती है और तब होती है जब वैश्विक प्रोटीन अनुवाद को हिचकते हैं। इसमें एसजीएस में स्थगित अनुवाद दीक्षा परिसरों का एकत्रीकरण शामिल है, जो कि अनुवादित रूप से निष्क्रिय एमआरएनए के लिए जगहों को माना जाता है, सेलुलर एमआरएनए के एक उपसंचर के चयनात्मक अनुवाद की अनुमति देता है।तनाव को हटाने पर, एसजीओं को भंग किया जाता है और प्रोटीन संश्लेषण की वैश्विक दरों को फिर से शुरू होता है। एसजीएस अनुवाद विस्तार प्रवर्तन कारक, आरएनए चयापचय में शामिल प्रोटीन, आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन, साथ ही मचान प्रोटीन और मेजबान सेल सिग्नलिंग में शामिल कारक हैं, हालांकि सटीक संरचना लागू होने वाले तनाव के आधार पर भिन्न हो सकती है। एसजी के गठन के लिए प्रेरित पर्यावरण कारकों में एमिनो एसिड भूख, यूवी विकिरण, गर्मी झटका, आसमाटिक सदमे, एंडोप्लास्मिक रेटिकुलम तनाव, हाइपॉक्सिया और वायरल संक्रमण 2 , 7 , 8 शामिल हैं । बहुत प्रगति को समझने में किया गया है कि वायरस कैसे प्रेरित करते हैं और एसजी के गठन को भी नष्ट करते हैं, जबकि अभी तक यह जान लिया जाता है कि बैक्टेरिया, कवक या प्रोटोजोअन रोगजनकों जैसे अन्य रोगजनकों के इस सेलुलर तनाव प्रतिक्रिया 1 , 7 को कैसे प्रभावित करते हैं।
Shigeएलएलए फ्लेन्क्निरी एक ग्राम-नकारात्मक प्रायोगिक साइटोसोलिक रोगज़नक़ा है और गंभीर दस्त या शिगलोसिस के प्रेरक एजेंट हैं। शिगेलोसिस एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य बोझ है और 5 साल की उम्र के 9 , 10 के तहत बच्चों में सालाना 28,000 मौतें होती हैं। एस फ्लेक्सनेरी कोलोनीक एपिथेलियम को संक्रमित करता है और मेजबान के साइटोकेकेलेटल घटकों 11 , 12 को अपहृत करके सेल-टू-सेल फैलता है। एपिथेलियम का संक्रमण साइटोकस के भीतर एस । फ्लेन्क्लेरी की प्रतिकृति का समर्थन करता है, लेकिन संक्रमित मैक्रोफेज पाइप्रोसिस नामक एक भड़काऊ कोशिका मृत्यु प्रक्रिया के माध्यम से मर जाते हैं। संक्रमण न्युट्रोफिल की भारी भर्ती और गर्मी, ऑक्सीडेटिव तनाव और ऊतक विनाश के साथ गंभीर सूजन की ओर जाता है। इस प्रकार, जबकि संक्रमित कोशिकाओं को संक्रमण से प्रेरित आंतरिक तनाव के अधीन होते हैं, जैसे गोल्गी विघटन, जीनोटॉक्सिक तनाव और साइटोस्केलेटल पुनर्व्यवस्थाएस, संक्रमित कोशिकाओं को भी भड़काऊ प्रक्रिया के कारण पर्यावरण तनाव के अधीन हैं
कई एसजी मार्करों का उपयोग करते हुए पर्यावरणीय तनाव पर प्रतिक्रिया करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता पर एस फ्लेन्डेरई संक्रमण के प्रभाव का लक्षण दिखाता है कि संक्रमण एसजी संरचना 3 में गुणात्मक और मात्रात्मक अंतर को दर्शाता है। हालांकि, अन्य बैक्टीरियल रोगजनकों के बारे में बहुत कम जानकारी है यहां हम साइटोसोलिक रोगज़न एस। फ्लेन्डेरी के साथ मेजबान कोशिकाओं के संक्रमण के लिए एक पद्धति का वर्णन करते हैं, विभिन्न पर्यावरणीय तनावों के साथ कोशिकाओं पर जोर देते हैं, एसजी घटकों के लेबलिंग और संक्रमित के संदर्भ में एसजी के गठन और संरचना का गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण और गैर-संक्रमित कोशिकाएं यह विधि व्यापक रूप से अन्य बैक्टीरियल रोगजनकों पर लागू होती है। इसके अलावा, एसजी के गठन का चित्र विश्लेषण वायरस या अन्य रोगजनकों द्वारा संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह एसजी का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैबहिष्कार तनाव के जवाब में एसजी के गठन पर संक्रमण या संक्रमण के प्रभाव पर प्रभाव।
यहां बताया गया प्रोटोकॉल गैर-संक्रमित कोशिकाओं और एसोसिएट्स के एसोसिएशन का विश्लेषण, साइटोसोलिक रोगज़न एस एस फ्लेन्डेरी से उत्पन्न होता है जो बाह्य तनाव की मौजूदगी या अनुपस्थिति में होता है। मुक…
The authors have nothing to disclose.
पी एस बिल और मेलिंडा गेट्स ग्रैंड चैलेंज अनुदान OPP1141322 के एक प्राप्तकर्ता है पीवी को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन के प्रारंभिक पोस्टडॉक मोबिलिटी फेलोशिप और रौक्स-कैंटरीनी पोस्टडॉक्टरल फेलोशिप का समर्थन किया गया था। पीजेएस एचएचएमआई अनुदान और ईआरसी -2013-एडीजी 339579-डिक्रिप्ट द्वारा समर्थित है।
Primary Antibodies | |||
eIF3b (N20), origin goat | Santa Cruz | sc-16377 | Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1 in 300 |
eIF3b (A20), origin goat | Santa Cruz | sc-16378 | Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1 in 300 |
eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) | Cell Signaling | 3411 | Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1 in 800 |
eIF4AI, origin goat | Santa Cruz | sc-14211 | Recommended by (Ref # 13). Dilution 1 in 200 |
eIF4B, origin rabbit | Abcam | ab186856 | Good stress granule marker in our hands. Dilution 1 in 300 |
eIF4B, origin rabbit | Cell Signaling | 3592 | Recommended by Ref # 13. Dilution 1 in 100 |
eIF4G, origin rabbit | Santa Cruz | sc-11373 | Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1 in 300 |
G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) | BD Biosciences | 611126 | Widely used SG marker. Dilution 1 in 300 |
Tia-1, origin goat | Santa Cruz | sc-1751 | Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1 in 300 |
Alexa-conjugated Secondary Antibodies | |||
A488 anti-goat , origin donkey | Thermo Fisher | A-11055 | Cross absorbed. Dilution 1 in 500 |
A568 anti-goat, origin donkey | Thermo Fisher | A-11057 | Cross absorbed. Dilution 1 in 500 |
A488 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A-21202 | Dilution 1 in 500 |
A568 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A10037 | Dilution 1 in 500 |
A647 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A31571 | Dilution 1 in 500 |
A488 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A-21206 | Dilution 1 in 500 |
A568 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A10042 | Dilution 1 in 500 |
Other Reagents | |||
Shigella flexneri | Available from various laboratories by request | ||
Tryptone Casein Soya (TCS) broth | BD Biosciences | 211825 | Standard growth medium for Shigella, application – bacterial growth |
TCS agar | BD Biosciences | 236950 | Standard growth agar for Shigella, application – bacterial growth |
Congo red | SERVA Electrophoresis GmbH | 27215.01 | Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application – bacterial growth |
Poly L lysine | Sigma-Aldrich | P1274 | Useful to coating bacteria to increase infection, application – infection |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application – infection |
HEPES | Life Technologies | 15630-056 | PH buffer useful when cells are incubated at room-temperature, application – cell culture |
DMEM | Life Technologies | 31885 | Standard culture medium for HeLa cells, application – cell culture |
Fetal calf serum | Biowest | S1810-100 | 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application – cell culture |
Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | 1/100 dilution used for HeLa cell culture medium, application – cell culture |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Reagent diluent, application – cell culture |
Sodium arsenite | Sigma-Aldrich | S7400 | Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application – stress inducer |
Clotrimazole | Sigma-Aldrich | C6019 | Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application – stress inducer |
PFA | Electron Microscopy Scences | 15714 | 4% PFA is used for standard fixation of cells, application – fixation |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application – permeabilization |
A647-phalloidin | Thermo Fisher | A22287 | Dilution is at 1/40, best added during 2ary antibody staining, application – staining |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application – staining |
Parafilm | Sigma-Aldrich | BR701501 | Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application – staining |
Prolong Gold | Thermo Fisher | 36930 | Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application – mounting |
Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting |
24-well cell culture plate | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Standard tissue culture plates, application – cell culture |
12-mm glass coverslips | NeuVitro | 1001/12 | Cell culture support for immunofluorescent applications, application – cell support |
forceps | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and obust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting |
Programs and Equipment | |||
Prism | GraphPad Software | Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application – data analysis | |
Leica SP5 | Leica Microsystems | Confocal microsope, application – image acquisition | |
Imaris | Bitplane | Professional image analysis program, application – data analysis | |
Excel | Microsoft | Data analysis and graphing program, application – data analysis |