哺乳動物細胞の細菌攻撃後のストレス顆粒形成の免疫蛍光分析
Summary
本発明者らは、細胞が細菌および多数の異なるストレスでチャレンジされた後の哺乳動物細胞におけるストレス顆粒形成の定性的および定量的分析のための方法を記載する。このプロトコルは、広範囲の宿主 – 細菌相互作用における細胞ストレス顆粒応答を調べるために適用することができる。
Abstract
細胞成分の蛍光イメージングは、宿主 – 病原体相互作用を調べるための有効なツールである。病原体は、細胞小器官の超微細構造、細胞骨格のネットワーク構成、ならびにストレス顆粒（SG）形成などの細胞プロセスを含む感染細胞の多くの異なる特徴に影響を及ぼし得る。どのように病原体が宿主プロセスを破壊するかの特徴付けは、病因の分野の重要かつ不可欠な部分である。様々な表現型が容易に目に見えるかもしれないが、病原体チャレンジによって誘発される細胞構造の定性的および定量的差異の正確な分析は、実験試料と対照試料との間に統計学的有意差を定義するために不可欠である。 SGの形成は、進化的に保存されたストレス応答であり、抗ウイルス応答をもたらし、ウイルス感染を用いて長く研究されてきた1 。 SG形成はまた、シグナル伝達カスケードに影響を及ぼし、他の未知のconseq2 。細菌病原体のようなウイルス以外の病原体に対するこのストレス応答の特徴付けは、現在、新たな研究領域3である 。今のところ、ウイルスの系においてさえも、SG形成の定量的および定性的分析はまだ日常的には用いられていない。ここで我々は、様々な外因性ストレスに応答してSGの形成に影響を与える、非感染細胞および細胞質細菌病原体に感染した細胞におけるSG形成を誘発および特徴付けするための簡単な方法を記載する。 SGの形成および組成の分析は、多数の異なるSGマーカーおよびオープンソース画像分析ツールであるICYのスポット検出器プラグインを使用することによって達成される。
Introduction
細胞レベルでの宿主 – 病原体相互作用の可視化は、病原性戦略への洞察を獲得し、主要な細胞経路を同定するための強力な方法である。事実、病原体は、自身の生存または増殖のための戦略として中央細胞プロセスを破壊するように進化しているので、病原体を重要な細胞標的または構造を特定するためのツールとして使用することができる。細胞成分の可視化は、蛍光標識された宿主タンパク質を組換え発現することによって達成することができる。これはリアルタイム分析を可能にするが、特異的に標識された宿主タンパク質を有する細胞株の生成は非常に面倒であり、望ましくない副作用をもたらし得る。複数の宿主因子を同時に分析することができ、特定の細胞型に限定されないため、特異的抗体を用いた細胞因子の検出がより便利である。欠点は、免疫蛍光分析が宿主細胞固定化を必要とするので、静的視野のみを捕捉できることであるイオン。しかしながら、免疫蛍光イメージングの重要な利点は、それが定性分析および定量分析の両方に容易に役立つことである。これは、次に、宿主 – 病原体相互作用への新しい洞察を提供するために統計的に有意な差異を得るために使用することができる。
蛍光画像解析プログラムは、3Dおよび4D解析を実行するための強力な解析ツールです。しかし、ソフトウェアの高コストとそのメンテナンスは、フリー・オープンソース・ソフトウェアに基づく方法をより広く魅力的にしています。バイオ分析ソフトウェアを使用した慎重な画像分析は、視覚分析を実証し、統計的有意性を割り当てるときに、所与の表現型の正確性に対する信頼性を高めるので有益である。これまで、SGは、個別のSG 4の手動識別を必要とする無料のImageJソフトウェアを使用して分析されていました。ここでは、bacの文脈における細胞SG形成の誘導および分析のためのプロトコルを提供するフリーオープンソースのバイオイメージ分析ソフトウェアICY（http://icy.bioimageanalysis.org）を使用して、腸内感染を検出した。バイオイメージ解析ソフトウェアには、SG解析に非常に適したスポット検出プログラムが組み込まれています。これにより、指定された関心領域（ROI）での自動検出プロセスの微調整が可能になります。これは、個々のSGの手動分析の必要性を克服し、サンプリングバイアスを除去する。
多くの環境ストレスは、直径0.2-5μmの相密度の高いサイトゾル、非膜構造であるSGの形成を誘発する5,6 。この細胞応答は、酵母、植物および哺乳動物において進化的に保存され、全身タンパク質翻訳が阻害される場合に起こる。これは、失活した翻訳開始複合体のSGへの凝集を含み、翻訳的に不活性なmRNAの保持場所と考えられ、細胞mRNAのサブセットの選択的翻訳を可能にする。ストレスを除去すると、SGが溶解し、タンパク質合成の全体的な速度が再開する。 SGは、翻訳伸長開始因子、RNA代謝に関与するタンパク質、RNA結合タンパク質、ならびに宿主細胞シグナリング2に関与するスカフォールドタンパク質および因子からなるが、正確な組成は適用されるストレスに依存して変化し得る。 SG形成を誘発する環境因子には、アミノ酸飢餓、UV照射、熱ショック、浸透圧ショック、小胞体ストレス、低酸素症およびウイルス感染が含まれる2,7,8。ウイルスがどのように誘導され、SGの形成を破壊するかについての理解が進んだが、細菌、真菌、原生動物病原体などの他の病原体がこの細胞ストレス応答にどのように影響するかについてはほとんど知られていない。
シゲIIフレクスナーは、ヒトのグラム陰性通性細胞質ゾル病原体であり、重度の下痢またはシゲラ症の原因物質である。シゲロシスは重大な公衆衛生上の負担であり、5歳未満の小児では毎年28,000人の死亡を引き起こす。 フレックスネリは結腸上皮に感染し、宿主の細胞骨格成分11,12をハイジャックすることにより細胞間拡散を起こす 。上皮の感染は、サイトゾル内でのフレクスネリ（ flexneri）の複製を支持するが、感染マクロファージは、熱中症と呼ばれる炎症性細胞死プロセスによって死ぬ。感染は、熱、酸化ストレスおよび組織破壊を伴う好中球および重度の炎症の大規模な動員につながる。したがって、感染細胞は、ゴルジ破壊、遺伝毒性ストレスおよび細胞骨格再編成などの感染によって誘導される内部ストレスを受ける炎症過程に起因する環境ストレスにさらされる。
多数のSGマーカーを用いて環境ストレスに応答する細胞の能力に対するS.フレックスネリ感染の特徴付けは、感染がSG組成3の定性的および定量的差異をもたらすことを実証した。しかしながら、他の細菌病原体についてはほとんど知られていない。ここでは、異なる環境ストレスを有する細胞のストレス、SG成分の標識、および感染の文脈におけるSGの形成および組成の定性的および定量的分析を含む、細胞質病原菌S.フレックスネリによる宿主細胞の感染のための方法論を説明する。および非感染細胞が含まれる。この方法は、他の細菌病原体に広く適用可能である。さらに、SG形成の画像分析は、ウイルスまたは他の病原体による感染のために使用され得る。それはSGを分析するために使用することができます外因性のストレスに応答したSG形成に対する感染の影響または感染の効果。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書に概説されたプロトコルは、外因性ストレスの存在下または非存在下で、非感染細胞および細胞質病原体S.フレクスナーネに感染した細胞におけるSGの誘導、局在化および分析を記載する。フリーイメージングソフトウェアを使用することにより、このプロトコルにより、SG形成の正確な定性および定量分析が可能となり、与えられた表現型の差異を同定および統計的に取り扱?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PSはBill and Melinda Gates Grand Challenge助成金OPP1141322の受領者です。 PVは、スイス国立科学財団早期ポストドックモビリティフェローシップとRoux-Cantarini博士後援フェローシップによって支えられました。 PJSはHHMIグラントとERC-2013-ADG 339579-Decryptによってサポートされています。
Materials
| Primary Antibodies | |||
| eIF3b (N20), origin goat | Santa Cruz | sc-16377 | Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1 in 300 |
| eIF3b (A20), origin goat | Santa Cruz | sc-16378 | Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1 in 300 |
| eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) | Cell Signaling | 3411 | Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1 in 800 |
| eIF4AI, origin goat | Santa Cruz | sc-14211 | Recommended by (Ref # 13). Dilution 1 in 200 |
| eIF4B, origin rabbit | Abcam | ab186856 | Good stress granule marker in our hands. Dilution 1 in 300 |
| eIF4B, origin rabbit | Cell Signaling | 3592 | Recommended by Ref # 13. Dilution 1 in 100 |
| eIF4G, origin rabbit | Santa Cruz | sc-11373 | Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1 in 300 |
| G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) | BD Biosciences | 611126 | Widely used SG marker. Dilution 1 in 300 |
| Tia-1, origin goat | Santa Cruz | sc-1751 | Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1 in 300 |
| Alexa-conjugated Secondary Antibodies | |||
| A488 anti-goat , origin donkey | Thermo Fisher | A-11055 | Cross absorbed. Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-goat, origin donkey | Thermo Fisher | A-11057 | Cross absorbed. Dilution 1 in 500 |
| A488 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A-21202 | Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A10037 | Dilution 1 in 500 |
| A647 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A31571 | Dilution 1 in 500 |
| A488 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A-21206 | Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A10042 | Dilution 1 in 500 |
| Other Reagents | |||
| Shigella flexneri | Available from various laboratories by request | ||
| Tryptone Casein Soya (TCS) broth | BD Biosciences | 211825 | Standard growth medium for Shigella, application – bacterial growth |
| TCS agar | BD Biosciences | 236950 | Standard growth agar for Shigella, application – bacterial growth |
| Congo red | SERVA Electrophoresis GmbH | 27215.01 | Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application – bacterial growth |
| Poly L lysine | Sigma-Aldrich | P1274 | Useful to coating bacteria to increase infection, application – infection |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application – infection |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | PH buffer useful when cells are incubated at room-temperature, application – cell culture |
| DMEM | Life Technologies | 31885 | Standard culture medium for HeLa cells, application – cell culture |
| Fetal calf serum | Biowest | S1810-100 | 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application – cell culture |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | 1/100 dilution used for HeLa cell culture medium, application – cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Reagent diluent, application – cell culture |
| Sodium arsenite | Sigma-Aldrich | S7400 | Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application – stress inducer |
| Clotrimazole | Sigma-Aldrich | C6019 | Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application – stress inducer |
| PFA | Electron Microscopy Scences | 15714 | 4% PFA is used for standard fixation of cells, application – fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application – permeabilization |
| A647-phalloidin | Thermo Fisher | A22287 | Dilution is at 1/40, best added during 2ary antibody staining, application – staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application – staining |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | BR701501 | Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application – staining |
| Prolong Gold | Thermo Fisher | 36930 | Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application – mounting |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting |
| 24-well cell culture plate | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Standard tissue culture plates, application – cell culture |
| 12-mm glass coverslips | NeuVitro | 1001/12 | Cell culture support for immunofluorescent applications, application – cell support |
| forceps | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and obust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting |
| Programs and Equipment | |||
| Prism | GraphPad Software | Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application – data analysis | |
| Leica SP5 | Leica Microsystems | Confocal microsope, application – image acquisition | |
| Imaris | Bitplane | Professional image analysis program, application – data analysis | |
| Excel | Microsoft | Data analysis and graphing program, application – data analysis | |
Referências
- Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436 (2), 255-267 (2013).
- Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
- Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -. X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation. Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).
- Kolobova, E., Efimov, A., et al. Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules. Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).
- Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
- Anderson, P., Kedersha, N. Stressful initiations. J Cell Sci. 115, 3227-3234 (2002).
- Mohr, I., Sonenberg, N. Host translation at the nexus of infection and immunity. Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).
- Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor. Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).
- Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
- Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children. PloS One. 8 (9), 72788 (2013).
- Ashida, H., Ogawa, M., et al. Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses. Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).
- Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).
- Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).
