Lasere anvendes ofte i studier af det cellulære respons på DNA beskadigelse. Men de generere læsioner, hvis afstand, hyppighed, og kollisioner med replikationsgafler sjældent karakteriseret. Her beskriver vi en fremgangsmåde, der muliggør bestemmelse af disse parametre med laser lokaliseret interstrengstværbindinger.
DNA Damage Response (DDR) er blevet grundigt karakteriseret i undersøgelser af dobbeltstrengsbrud (DSB'er) induceret af laser micro bestrålingen i levende celler. DDR til helix fordreje covalente DNA modifikationer, herunder interstrengs DNA tværbindinger (ICLS), er ikke så veldefinerede. Vi har undersøgt DDR stimuleret af ICLS, lokaliseret ved hjælp af laser fotoaktivering af immunotagged psoralener, i kerner af levende celler. For at løse fundamentale spørgsmål om addukt distribution og replikationsgaffel møder, vi kombineret laser lokalisering med to andre teknologier. DNA fibre ofte bruges til at vise forløbet af replikationsforgreninger ved immunfluorescens af nukleosidanaloger inkorporeret under korte impulser. Immunoquantum prikker er ofte blevet anvendt til enkelt molekyle billeddannelse. I den nye fremgangsmåde er DNA fibre fra celler, der bærer laser lokaliserede ICLS spredes på mikroskopobjektglas. De mærkede ICLS vises med immunoquantum prikker og the inter-læsion afstande bestemt. Replikationsgaffel sammenstød med ICLS kan visualiseres og forskellige støder mønstre identificeres og kvantificeres.
DNA er under konstant angreb fra eksogene midler såsom stråling, ultraviolet lys, miljømæssige toksiner, forbrændingsprodukter, etc. Endvidere er det også angrebet af endogene radikaler produceret af oxidativ metabolisme. Alle disse har potentiale til kemisk eller fysisk forstyrre integriteten af DNA 1. Forstyrrelser i genomet kan aktivere DNA Damage Response (DDR), en rekruttering og posttranslationel modifikation kaskade med hundredvis, hvis ikke tusinder, af proteiner og microRNA involveret i læsion reparation, regulering af cellecyklussen, apoptose, fremadskridende alderdom og inflammatoriske pathways 2.
De fleste af vores information om DDR, kommer fra studier med DSBs. Dette er i vid udstrækning på grund af tilgængeligheden af teknologier til indføring pauser, herunder sekvensspecifikke pauser, i genomisk DNA i levende celler 3. Desuden propensity af pauser til at inducere foci af DDR-proteiner, som kan vises ved hjælp af immunfluorescens, har været meget nyttigt til identifikation af kinetikken og krav i responderende proteiner. En af de vigtigste teknologier til at studere DDR blev introduceret af Bonner og kolleger, der brugte en laserstråle til at lede en stribe af DSBs i en "Region of Interest" (ROI) i kerner af levende celler 4. I realiteten skabte de en langvarig fokus, hvor proteiner af DDR kunne identificeres ved immunfluorescens. Dette blev illustreret ved deres demonstration af stærk stribe af phosphoryleret histon H2AX (γ-H2AX) i laser eksponerede celler. Siden da har laser fremgangsmåde været anvendt i talrige undersøgelser af DDR induceret af DSB'er. Selvom kraftfulde og populære, og kilden til dramatiske immunofluorescens billeder, skal det bemærkes, at laseren intensitet i de fleste forsøg er justeret således at producere observerbare resultater, uden bekymring for læsion identitet,densitet, eller indbyrdes afstand. Faktisk kan det være vanskeligt at foretage disse skøn. De er således stort set ignoreret, trods de mange læsioner indført i DNA ved lasere 5. Dette bidrager til de mange modsætninger i litteraturen 6.
I modsætning til DSBs, de fleste kemiske modifikationer af DNA ikke stimulere dannelsen af diskrete foci af DDR-proteiner. Dette er vigtigt i lyset af vores nuværende forståelse af læsion frekvenser. Det er blevet anslået, at humane celler i kultur pådrage så mange som 50 DSB'er per celle cyklus, der dannes i høj grad under S-fasen 7, 8, 9. Færre dannes i ikke-prolifererende celler. Dette står i modsætning til antallet af nucleobase tab eller modifikation begivenheder, som i titusindvis per celle / dag 1, 10. Således ved vi mest omDDR fremkaldt af begivenheder, der er relativt sjældne, og meget mindre om dem fremkaldt af helix forvridende læsioner, som tilsammen er langt mere almindelige.
For at afhjælpe spørgsmål om det cellulære respons på kovalente modifikationer af genomisk DNA, vi ønskede at arbejde med en helix fordreje DNA addukt, havde iboende DDR induktionsaktivitet. Desuden for at lette eksperimentelle design og fortolkning vi var interesserede i en struktur, hvis introduktion kan kontrolleres med hensyn til tid og var modtagelig for visualisering. Derfor udviklede vi en strategi baseret på psoralen. Psoralener er velkarakteriserede fotoaktive DNA-interkalatorer favoriserer 5'TA: AT sites. I modsætning til andre tværbindingsmidler såsom nitrogensennepper og mitomycin C (MMC) de er ikke DNA reaktive medmindre udsat for langbølget UV (UVA) lys. De indskudte molekyler reagerer med thyminbaser på modsatte strenge at producere helix fordreje interstrengstværbindinger (ICLS) 11. Med trimethyl psoralen anvendt i vores eksperimenter fleste produkter er ICLS, relativt få monoadducts genereres (mindre end 10%) 12 og intrastreng tværbindinger mellem tilstødende baser på én streng er ikke dannet. Fordi de er stærke blokke til replikation og transkription, psoralen og andre tværbindingsmidler, ligesom cis-platin og MMC, er almindeligt anvendt i kemoterapi. Således psoralen aktiveret undersøgelser, der fulgte aktiveringen af DDR ved en helix fordreje struktur, og også leveret indsigt i den cellulære reaktion til en forbindelse med klinisk betydning.
Syntetiserede vi et reagens, hvori trimethyl psoralen var knyttet til digoxigenin (DIG), en plantesterol ikke findes i pattedyrceller og anvendes hyppigt som et immunotag. Kravet om fotoaktivering tillader lokalisering af laserlys (365 nm) af psoralen ICLS i definerede ROI i kerner i levende celler. Disse kan vises ved immunofluorescence mod Dig tag. DNA-reparation og DDR-proteinerne syntes i striberne af laser lokaliserede ICLS 13, 14.
DDR aktiveres ved de høje laser intensiteter anvendes til fremstilling af DSB'er kunne skyldes isoleret eller grupperet skade 15, 16. Følgelig til relevansen af resultater fra disse forsøg naturligt forekommende læsioner, til stede i meget lavere koncentration, er usikker. For at løse lignende spørgsmål om psoralen addukt frekvens og afstand i DNA, tog vi fordel af DNA fiberteknologi 17 og immunoquantum prikker. Kvantepunkter er meget lysere end fluorescerende farvestoffer og er ikke bleget af udsættelse for lys. De er således ofte til enkelt molekyle billeddannelse 18, en ansøgning, som fluorescerende farvestoffer er tilstrækkeligt lyse. Individuelle DNA fibre kan strækkes på glass rutschebaner og kan vises ved immunofluorescens mod nukleosidanaloger inkorporeret under inkubationer før cellehøst. Vi behandlede celler med Dig-psoralen og udsat ROI for laser micro bestråling. Fibre blev fremstillet fra cellerne og individuelle Dig-psoralen addukter kunne visualiseres med immunoquantum prikker. Udsættelse af cellerne for nukleosidanaloger for relativt korte tidsrum (20-60 min) tillader visningen af replikations skrifter i nærheden af laser lokaliseret ICLS.
Laseren lokalisering teknologi kræver anvendelse af adhærerende celler med kerner, der er synlige i lysfeltmikroskopi. Vi har forsøgt at vedhæfte vedhæftede celler, såsom primære lymfocytter eller løst adhærerende dyrkede celler, såsom AD293, til glasoverfladen med celleadhæsive præparater, såsom polylysin eller kollagen, eller mere komplekse blandinger. Selv om disse behandlinger kan binde cellerne til overfladen, finder vi, at de generelt forblive afrundet gør det meget vanskeligt at fokusere ind i kerne…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev delvist understøttet af den Intramural forskningsprogram for NIH, National Institute on Aging (Z01 AG000746-08) og fanconis anæmi Research Fund.
Digoxigenin NHS ester | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
Chloro-psoralen | Berry and Associates | PS 5000 | |
diaminoglycol | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine |
Chloroform | Acros Organics | 423550040 | |
Methanol | Fisher Scientific | A4524 | |
Ammonium solution | Sigma-Aldrich | 5002 | |
TLC plates | Analtech, Inc. | P02511 | |
Flass glass column 24/40, 100ml | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder | Perkin Elmer | With Volocity Software | |
Micropoint Galvo | Andor Technologies | with a Nitrogen pulsed laser | |
dye cell | Andor Technologies | MP-2250-2-365 | |
365 dye | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
35mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10mm glass diameter, uncoated | Matek | P35G-1.5-10-C | |
microscope slides | New Comer Supply | Part # 5070 | New Silane Slides |
Mouse anti BrdU antibody (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 1 in 40 |
Rat anti BrdU Antibody (CldU) | Abcam | ab6326 | 1 in 200 |
Rabbit anti Dig antibody | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 in 200 |
Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 in 5000 |
AF647- goat anti Rat IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 in 100 |
AF488-goat anti mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 in 100 |
Zeiss epifluorescent microscope A200 | Zeiss | with Axiovision software | |
Q-dot 655 filter | Chroma | 39107 |