Single Molecule Analyse van de Laser Gelokaliseerde Psoralen Adducten
Summary
Lasers worden vaak gebruikt in studies van de cellulaire respons op DNA-schade. Echter, ze genereren lesies waarvan de afstand, frequentie en botsingen met replicatievorken worden zelden gekenmerkt. We beschrijven een benadering die de bepaling van deze parameters laser gelokaliseerde crosslinks tussen de strengen mogelijk maakt.
Abstract
Het DNA Damage Response (DDR) is uitgebreid gekarakteriseerd in studies van dubbelstrengs breuken (DSB's) veroorzaakt door micro laser bestraling in levende cellen. De DDR aan helix vervormen DNA covalente modificaties, waaronder DNA crosslinks tussen de strengen (ICL) is niet goed gedefinieerd. We hebben de DDR gestimuleerd door ICL, gelokaliseerd met behulp van laser foto-activatie van immunotagged psoralenen bestudeerd, in de kernen van levende cellen. Om fundamentele vragen over adductverdeling en replicatie vork ontmoetingen pakken, combineerden we laser lokalisatie met twee andere technologieën. DNA vezels worden vaak gebruikt om de voortgang van replicatievorken door immunofluorescentie of nucleosideanalogen ingebracht gedurende korte pulsen geven. Immunoquantum stippen zijn op grote schaal gebruikt voor single molecule imaging. In de nieuwe benadering worden DNA vezels uit cellen die laser gelokaliseerd ICLs uitgespreid op microscoopglaasjes. De getagde ICLs worden weergegeven met immunoquantum stippen en the inter-laesie afstanden bepaald. Replicatievorksnelheid botsingen met ICLs kunnen worden gevisualiseerd en verschillende patronen ontmoeting geïdentificeerd en gekwantificeerd.
Introduction
DNA wordt voortdurend aanval door exogene middelen zoals bestraling, ultraviolet licht, giftige stoffen, verbrandingsproducten, etc. Daarnaast wordt ook aangetast door endogene radicalen geproduceerd door oxidatief metabolisme. Deze hebben het potentieel om de integriteit van DNA 1 chemisch of fysisch te verstoren. Verstoringen in het genoom kan de DNA Damage Response (DDR), een werving en post-translationele modificatie cascade met honderden te activeren, zo niet duizenden, van eiwitten en microRNAs die betrokken zijn bij laesie reparatie, regulatie van de celcyclus, apoptose, veroudering, en inflammatoire pathways 2.
De meeste van onze informatie over de DDR afkomstig uit studies met DSB. Dit is grotendeels vanwege de beschikbaarheid van technieken voor het inbrengen pauzes, zoals sequentiespecifieke onderbrekingen, in genoom DNA in levende cellen 3. Bovendien, de propensity van pauzes om brandpunten van DDR-eiwitten, die kan worden weergegeven door immunofluorescentie veroorzaken, is zeer nuttig geweest voor het identificeren van de kinetiek en eisen te reageren eiwitten. Een van de belangrijkste technologieën voor het bestuderen van de DDR werd geïntroduceerd door Bonner en collega's, die een laserstraal in de kernen van levende cellen 4 gebruikt om een streep van DSB's te richten in een "Region of Interest" (ROI). In feite, creëerden ze een langdurige focus op welke eiwitten van de DDR konden worden geïdentificeerd met immunofluorescentie. Dit werd geïllustreerd door de demonstratie van de sterke streep gefosforyleerd histon H2AX (γ-H2AX) in de laser-belichte cellen. Sindsdien is de laser aanpak toegepast in tal van studies van de DDR veroorzaakt door DSB. Hoewel krachtig en populair, en de bron van dramatische immunofluorescentie beelden, dient te worden opgemerkt dat in de meeste experimenten de laser intensiteit wordt aangepast om waarneembare resultaten te produceren, zonder zorg voor laesie identiteit,dichtheid of tussenruimte. Inderdaad, kan het moeilijk zijn om deze schattingen te maken. Aldus worden zij grotendeels genegeerd, ondanks het grote aantal laesies in DNA geïntroduceerd door lasers 5. Dit draagt bij aan de vele tegenstrijdigheden in de literatuur 6.
In tegenstelling tot DSB meeste chemische modificaties van DNA niet de vorming van afzonderlijke foci van DDR eiwitten stimuleren. Dit is belangrijk in het licht van onze huidige kennis van laesie frequenties. Er wordt geschat dat menselijke cellen in kweek gebracht wel 50 DSB's per celcyclus grotendeels gevormd tijdens S-fase 7, 8, 9. Minder gevormd in niet-prolifererende cellen. Dit in tegenstelling tot het aantal nucleobase verlies of wijziging gebeurtenissen, die in de tienduizenden per cel / dag 1, 10. Dus, we weten het meest overde DDR opgewekt door gebeurtenissen die relatief zeldzaam, en veel minder over die geïnduceerd door helix vervormen laesies, die globaal slechts veel vaker voorkomen.
Met het oog op vragen over de cellulaire respons op wijzigingen van genoom DNA covalente aan te pakken, willen we aan de slag met een helix verstorende DNA adduct dat inherent DDR inductieactiviteit gehad. Verder naar experimenteel ontwerp te vergemakkelijken en de interpretatie we geïnteresseerd waren in een structuur waarvan het binnenbrengen zou kunnen worden gecontroleerd met betrekking tot de tijd en was vatbaar voor visualisatie. Daarom ontwikkelden we een strategie gebaseerd op psoralen. Psoralenen goed gekarakteriseerd fotoactieve DNA intercalerende begunstiging 5'TA: AT sites. In tegenstelling tot andere verknopingsmiddelen zoals stikstof mosterd en mitomycine C (MMC) niet met DNA reactief indien blootgesteld aan lange golf UV (UV) licht. De geïntercaleerde moleculen reageren met thymine basen aan tegenoverliggende strengen helix vervormen crosslinks tussen de strengen te produceren (ICL) 11. Met trimethyl psoralen gebruikt in onze experimenten meeste producten ICLs, relatief weinig monoadducten gegenereerd (minder dan 10%) 12 en intrastrengs verknopingen tussen aangrenzende basen op één streng worden gevormd. Omdat ze krachtige blokken replicatie en transcriptie, psoraleen en andere verknopingsmiddelen, zoals cis-platina en MMC, worden vaak gebruikt bij chemotherapie. Zo psoralen ingeschakeld studies dat de activering van de DDR, gevolgd door een helix vervormen structuur, en ook inzicht gegeven in de cellulaire reactie op een verbinding met de klinische belang.
We synthetiseerden een reagens waarin trimethyl psoralen is verbonden met digoxigenine (Dig), een plantensterol niet in zoogdiercellen en vaak gebruikt als immunotag. De vereiste fotoactivatie maakt lokalisatie met laserlicht (365 nm) van psoraleen ICLs in vastgestelde ROI kernen in levende cellen. Deze kunnen worden weergegeven door immunofluorescence tegen de Dig tag. DNA herstel en DDR eiwitten verscheen in de strips van laser gelokaliseerde ICLs 13, 14.
De DDR geactiveerd door de hoge laserintensiteiten gebruikt voor DSB's te produceren kan het gevolg zijn geïsoleerde of geclusterde schade 15, 16. Bijgevolg is de relevantie van de resultaten van deze experimenten natuurlijk voorkomende laesies aanwezig bij veel lagere concentratie, is onzeker. Op soortgelijke vragen over psoraleen adduct frequentie en tussenruimte in het DNA aan te pakken, hebben we geprofiteerd van DNA vezeltechnologie 17 en immunoquantum stippen. Quantum dots zijn veel helderder dan fluorescerende kleurstoffen en zijn niet gebleekt door blootstelling aan licht. Zo worden ze vaak gebruikt voor single molecule imaging 18 de toepassing waarvoor fluorescente kleurstoffen onvoldoende licht. DNA afzonderlijke vezels kunnen worden gespannen op glass schuiven en kan worden weergegeven door immunofluorescentie tegen nucleoside analogen ingebracht gedurende incubaties vóór oogst cel. We behandelde cellen met Dig-psoraleen en blootgesteld de ROI te laser micro bestraling. Vezels werden bereid uit de cellen en individuele Dig-psoraleen adducten kunnen worden gevisualiseerd met de immunoquantum stippen. Blootstellen van de cellen aan nucleoside-analogen relatief korte tijd (20-60 min) maakt de weergave van replicatie streken in de nabijheid van de laser gelokaliseerde ICL.
Protocol
Representative Results
Discussion
De laser lokalisatie techniek vereist het gebruik van hechtende cellen met kernen die zichtbaar helderveld microscopie. We hebben geprobeerd om niet hechtende cellen, zoals primaire lymfocyten of losjes hechtende gekweekte cellen zoals AD293 hechten aan het glasoppervlak met celhechtend preparaten zoals polylysine of collageen, of meer complexe mengsels. Hoewel deze behandelingen van de cellen naar de oppervlakte kunnen binden, vinden we dat zij over het algemeen blijven afgerond waardoor het erg moeilijk om zich te con…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd mede ondersteund door de Intramurale Research Program van de NIH, National Institute on Aging (Z01 AG000746-08) en de Fanconi Bloedarmoede Research Fund.
Materials
| Digoxigenin NHS ester | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Chloro-psoralen | Berry and Associates | PS 5000 | |
| diaminoglycol | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine |
| Chloroform | Acros Organics | 423550040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4524 | |
| Ammonium solution | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC plates | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Flass glass column 24/40, 100ml | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
| Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder | Perkin Elmer | With Volocity Software | |
| Micropoint Galvo | Andor Technologies | with a Nitrogen pulsed laser | |
| dye cell | Andor Technologies | MP-2250-2-365 | |
| 365 dye | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| 35mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10mm glass diameter, uncoated | Matek | P35G-1.5-10-C | |
| microscope slides | New Comer Supply | Part # 5070 | New Silane Slides |
| Mouse anti BrdU antibody (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 1 in 40 |
| Rat anti BrdU Antibody (CldU) | Abcam | ab6326 | 1 in 200 |
| Rabbit anti Dig antibody | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 in 200 |
| Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 in 5000 |
| AF647- goat anti Rat IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 in 100 |
| AF488-goat anti mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 in 100 |
| Zeiss epifluorescent microscope A200 | Zeiss | with Axiovision software | |
| Q-dot 655 filter | Chroma | 39107 |
Referências
- Lindahl, T. The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).
- Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272 (2013).
- Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).
- Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O’Neill, P. Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage – when is a DSB not a DSB?. Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).
- Aguilera, A., Garcia-Muse, T. Causes of genome instability. Annu. Rev. Genet. 47, 1-32 (2013).
- Swenberg, J. A., et al. Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment. Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).
- Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions. J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).
- Lai, C., et al. Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation. Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).
- Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells. J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).
- Nowsheen, S., et al. Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues. Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).
- Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).
- Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. J Vis. Exp. (56), e3255 (2011).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).
- Huang, J., et al. Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks. Front Genet. 7, 84 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).
- Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts. Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).
- Poirier, M. C. Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples. Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).
- Henderson, A., et al. Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).
