治療抗体間の標的結合およびCDC誘導を比較するためのインビトロ法：Biosimilarity Analysisにおける応用

Summary

このプロトコルは、リツキシマブの2つの重要な機能特性、すなわち標的結合および補体依存性細胞傷害（CDC）誘導のin vitro比較を記載する。この方法は、参照リツキシマブとリツキシマブバイオシミラーとの間での左右比較のために用いられた。これらのアッセイは、バイオシミラーの開発中またはその製造における品質管理として使用することができる。

Abstract

治療用モノクローナル抗体（mAb）は、癌を含む様々な病状の治療に関連する。製薬企業によるバイオシミラーmAbの開発は市場機会であるが、薬物接近性を高め、治療関連コストを削減する戦略でもある。本明細書で詳述するプロトコルは、Daudi細胞におけるリツキシマブによる標的結合およびCDC誘導の評価を記載する。これらの2つの機能は、抗体の異なる構造領域を必要とし、リツキシマブによって誘発される臨床効果に関連する。これらのプロトコールは、参照リツキシマブと市販のリツキシマブバイオシミラーの横から縦の比較を可能にする。評価された製品は、標的結合およびCDC誘導の両方において差異を示し、基礎的な物理化学的な相違点があることを示唆し、臨床設定におけるこれらの相違の影響を分析する必要性を強調した。ここに報告された方法は、単純で安価なin vitro <リツキシマブ・バイオシミラーの活性の評価のためのモデルである。したがって、それらは、バイオシミラーの開発中、ならびにバイオシミラー生成における品質管理のために有用であり得る。さらに、提示された方法は、他の治療用mAbに外挿することができる。

Introduction

治療用抗体は、癌、自己免疫疾患および慢性疾患、神経障害、および他の¹を含む種々の病状の治療のために開発された組換えモノクローナル抗体（mAb）です。現在、FDAは、40の以上の治療のmAbを承認した、とよりは、次の年に市場に達すると予想されています。

リツキシマブは、CD20 ⁺ B細胞非ホジキンリンパ腫（NHL）、CD20 ⁺濾胞性NHL、慢性リンパ球性白血病、および慢性関節リウマチ^2,3の治療のために承認された高親和性キメラモノクローナルIgG1抗体です。リツキシマブによるB細胞において過剰発現されるCD20の認識は、アポトーシスを誘導します。補体活性化。および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害^{（ADCC）3。}この薬の特許は2013年と2016年にヨーロッパで、米国で期限切れそれぞれ、したがって、世界中の製薬企業はリツキシマブ・バイオシミラーを開発している。他のヒト麻薬薬と同様に、バイオシミラーは規制当局の承認を必要とする。国際ガイドラインによると、モノクローナル抗体では、新生物および参照産物の物理化学的特性、薬物動態、有効性、および安全性を比較することによって、生体親和性を実証する必要がある⁴ 。

したがって、そのような比較に使用される方法論は、mAb、特に臨床的に関連性のあるものの構造的および機能的特性を評価しなければならない。そのために、 in vitroアッセイは、in vivo実験（Chapman et al。で概説されている ） ^5に比べていくつかの利点を示す：i） in vitro研究は、提案されたバイオシミラーと参照産物との間の差異により敏感である。 ii） in vivo試験は、関連する種において実施されなければならず、多くのmAbについて、非ヒト霊長類; iii）作用機序、前臨床毒性学、および参照産物の臨床効果は周知であるため、バイオシミラーを用いたインビボ研究はさらなる有用な情報を提供しない可能性がある。したがって、欧州連合（EU）のバイオシミラーのガイダンスにより、候補者は強力なインビトロデータのみに基づいて臨床試験に入ることができる⁶ 。

ここでは、CD20 ⁺培養細胞を用いたリツキシマブの生物学的活性を評価する2つの迅速、経済的、および単純なアッセイを提示する。これらのアッセイは、リツキシマブのバイオシミラー候補の比較練習の一部として含めることができます。

Protocol

フローサイトメトリーによる標的結合の評価 生物学的材料および試薬の調製 10％熱不活性化ウシ胎仔血清（H-IFBS）を添加したRPMI培地500mLを調製する。 培養Daudi Burkittのリンパ腫（Daudi）細胞およびDaudi GFP +細胞（RPMIおよび75cm 2培養フラスコを使用）。 5％CO 2加湿雰囲気で37℃、6〜9×10 5細胞/ mLになるまで培養物を維持する。 </l…

Representative Results

上記のプロトコルを用いて、標的結合および参照リツキシマブのCDC誘導を、アジアで産生され市販されているバイオシミラーリツキシマブのものと並行して比較した。 Daudi細胞では、両方のmAbがCD20に濃度依存的に結合した（ 図1D ）。結合データの非線形回帰は、参照およびバイオシミラーのリツキシマブそ?…

Discussion

治療用mAbの特許満了により、バイオシミラーの開発が促進されている。したがって、これらの製品の臨床的に関連する活動における差異を特定することができる簡単な方法が必要とされている。 CD20 ⁺培養細胞を、リツキシマブ：標的結合およびCDC誘導の2つの重要な機能特性の評価のために用いた。前者の活性はmAbのFab領域によるCD20の認識を必要とするが、後者は主にFc領域とその相…

Materials

RPMI-1640 medium	ATCC	30-2001	Modify the culture depending on the cell line
Trypan Blue solution	Sigma	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Daudi Burkitt's Lymphoma Cells	ATCC	CCL-213	You can modify the cell line depending on the antibody of interest
Fetal bovine serum(FBS)	GIBCO	16000-044	You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line
Normal Human Serum Complement	Quidel	A113	It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications
7AA-D	BDPharmigen	559925	You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability.
PECy5 Mouse Anti-human IgG	BDPharmigen	551497	Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer.
Human IgG Isotype Control	ThermoFisher Scientific	07-7102	Change depending to mAb
BDCytofix	BDPharmigen	554655	Flow Cytometry Fixation Buffer (1-4% formaldehyde or paraformaldehyde )
PBS pH 7.4 10X (Phosphate buffer saline)	GIBCO	70011-044	Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free.
Cell culture plates 96 well, V-bottom	Corning	29442-068	12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U- bottom microtiter plates
MabThera (Rituximab)	Roche	—	Reference product
Rituximab	Indian	—	Biosimilar product
15- or 50-mL conical centrifuge tubes	Corning	430290 or 430052	—
Pipette Tips	Eppendorf	—	Multiple volume configurations are necessary
Pipettes	Eppendorf	—	Adjustable-volume pipettes are necessary
Centrifuge 5430/ 5430R model	Eppendorf	—	Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 ° C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g
Flow cytometer	BD Dickinson	—	BD FACSAria III or other flow cytometer
Olympus optical and light microscope	Olympus	—	To quantify and evaluate cell growth
Incubator	SANYO	—	Incubatorfor temperature andCO2 control to culture cells
Biological Safety Cabinet	CHC BIOLUS	—	Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment.