In vitro- metoder for sammenligning av målbinding og CDC-induksjon mellom terapeutiske antistoffer: applikasjoner i biosimilaritetsanalyse

Summary

Denne protokollen beskriver in vitro-sammenligning av to viktige funksjonelle egenskaper rituximab: målbindingsdomene og komplementavhengig cytotoksisitet (CDC) induksjon. Metodene som ble benyttet for en side-til-side-sammenligning mellom referanse rituximab rituximab og en biosimilar. Disse analyser kan anvendes under biosimilar utvikling eller som en kvalitetskontroll i sin produksjon.

Abstract

Terapeutiske monoklonale antistoffer (mAbs) er relevant ved behandling av forskjellige sykdommer, inkludert kreft. Utviklingen av biosimilar mAbs av farmasøytiske selskaper er en markedsmulighet, men det er også en strategi for å øke narkotika tilgjengelighet og redusere behandlingsrelaterte kostnader. Protokollene som beskrevet her beskriver evalueringen av target-binding og CDC-induksjon med rituximab i Daudi-celler. Disse to funksjonene krever forskjellige strukturelle regioner av antistoff og er relevante for den kliniske virkning indusert av rituximab. Protokollene side-til-side-sammenligning av et referanse rituximab og et markedsført rituximab biosimilar. De evaluerte produktene viste forskjeller både i target-binding og CDC induksjon, noe som antyder at det er underliggende fysikalsk-kjemiske forskjeller, og fremhever behovet for å analysere virkningen av disse forskjeller i klinisk sammenheng. De metoder beskrevet her utgjør enkel og billig in vitro </ Em> modeller for evaluering av aktiviteten til rituximabbiosimilarer. Dermed kan de være nyttige under biosimilar utvikling, så vel som for kvalitetskontroll i biosimilar produksjon. Videre kan de fremstilte metoder ekstrapoleres til andre terapeutiske mAbs.

Introduction

Terapeutiske antistoffer rives rekombinante monoklonale antistoffer (mAbs) som er utviklet for behandling av forskjellige sykdommer, inkludert kreft, autoimmune og kroniske sykdommer, nevrologiske lidelser, og andre ^1. Foreløpig har FDA gitt godkjenning til mer enn 40 terapeutiske mAbs, og flere er ventet å komme på markedet i de neste årene.

Rituximab er et høy-affinitet kimært monoklonalt IgG1 antistoff godkjent for behandling av CD20 ⁺ B-celle-non-Hodgkins lymfom (NHL), CD20 ⁺ follikulær NHL, kronisk lymfocytisk leukemi, og reumatoid artritt ^{2, 3.} Erkjennelsen av CD20, som er overuttrykt i B-celler, ved rituximab induserer apoptose; komplement aktivering; og antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC) ^3. Patentene av dette stoffet utløpt i Europa og i USA i 2013 og 2016, Henholdsvis. Dermed utvikler farmasøytiske selskaper over hele verden rituximabbiosimilarer. Som i ethvert annet legemiddel til konsum, krever biosimilarer godkjenning fra reguleringsorganer. Internasjonale retningslinjer indikerer at for mAbs bør biosimilaritet påvises ved å sammenligne de fysisk-kjemiske egenskapene, farmakokinetikken, effekten og sikkerheten til de nye og referanseproduktene ⁴ .

Følgelig må metodene som brukes i slike sammenligninger vurdere de strukturelle og funksjonelle egenskapene til mAbs, spesielt de med klinisk relevans. Til det formål viser in vitro- analyser flere fordeler i forhold til in vivo- eksperimenter (gjennomgått i Chapman et al. ) ⁵ : i) in vitro- studier er mer sensitive for forskjeller mellom de foreslåtte biosimilar og referanseproduktet; Ii) in vivo studier må utføres i relevante arter, som for mange mAbs erikke-humane primater; og iii) siden virkningsmekanisme, den prekliniske toksikologi, og de kliniske virkningene av referanseproduktet er vel kjent in vivo-studier med biosimilars kan ikke gi ytterligere nyttig informasjon. Følgelig EUs Veiledning for biosimilars gjør kandidatene til å gå inn kliniske studier basert på robust in vitro-data alene ^seks.

Her presenterer vi to raske, økonomiske og enkle analyser som evaluerer den biologiske aktiviteten til rituximab ved hjelp av CD20 ⁺ dyrkede celler. Disse analysene kan inngå som en del av sammenlignbarhet øvelsen for rituximab biosimilar kandidater.

Protocol

1. Evaluering av målbinding ved hjelp av flytcytometri Fremstilling av biologiske materialer og reagenser Lag 500 ml RPMI-dyrkningsmedium tilsatt 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (H-IFBS). Kultur Daudi Burkitts lymfom (Daudi) celler og Daudi GFP + celler ved bruk av RPMI og 75 cm 2 kulturflasker. Opprettholde kulturer ved 37 ° C i en 5% CO 2 fuktig atmosfære til de når 6 – 9 x 10 5 celler / ml. Lag 50 ml farg…

Representative Results

Ved hjelp av de protokoller som er beskrevet ovenfor, mål-binding og CDC induksjon av referanse rituximab ble sammenlignet i parallell med de til en biosimilar rituximab produsert og kommersielt tilgjengelig i Asia. I Daudi-celler, både mAbs bundet CD20 på en konsentrasjonsavhengig måte (figur 1D). Ikke-lineære regresjoner av bindingsdataene viste en r 2 på 0,978 og 0,848 for referanse og bios…

Discussion

Patentutløpet av et terapeutisk mAb er å fremme utviklingen av biosimilarer. Dermed er det behov for enkle metoder som kan identifisere forskjeller i klinisk relevante aktiviteter av disse produktene. CD20 ⁺ dyrkede celler ble benyttet for evaluering av to sentrale funksjonelle karakteristika ved rituximab: målbinding og CDC-induksjon. Den tidligere aktiviteten krever anerkjennelse av CD20 av Fab-regionen av mAb, mens sistnevnte hovedsakelig avhenger av samspillet mellom Fc-regionen og dets komplement <sup…

Materials

RPMI-1640 medium	ATCC	30-2001	Modify the culture depending on the cell line
Trypan Blue solution	Sigma	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Daudi Burkitt's Lymphoma Cells	ATCC	CCL-213	You can modify the cell line depending on the antibody of interest
Fetal bovine serum(FBS)	GIBCO	16000-044	You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line
Normal Human Serum Complement	Quidel	A113	It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications
7AA-D	BDPharmigen	559925	You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability.
PECy5 Mouse Anti-human IgG	BDPharmigen	551497	Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer.
Human IgG Isotype Control	ThermoFisher Scientific	07-7102	Change depending to mAb
BDCytofix	BDPharmigen	554655	Flow Cytometry Fixation Buffer (1-4% formaldehyde or paraformaldehyde )
PBS pH 7.4 10X (Phosphate buffer saline)	GIBCO	70011-044	Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free.
Cell culture plates 96 well, V-bottom	Corning	29442-068	12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U- bottom microtiter plates
MabThera (Rituximab)	Roche	—	Reference product
Rituximab	Indian	—	Biosimilar product
15- or 50-mL conical centrifuge tubes	Corning	430290 or 430052	—
Pipette Tips	Eppendorf	—	Multiple volume configurations are necessary
Pipettes	Eppendorf	—	Adjustable-volume pipettes are necessary
Centrifuge 5430/ 5430R model	Eppendorf	—	Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 ° C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g
Flow cytometer	BD Dickinson	—	BD FACSAria III or other flow cytometer
Olympus optical and light microscope	Olympus	—	To quantify and evaluate cell growth
Incubator	SANYO	—	Incubatorfor temperature andCO2 control to culture cells
Biological Safety Cabinet	CHC BIOLUS	—	Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment.