שיטת Aggregation Cell יעילה וגמישה עבור הפקת 3D אליפטית
Summary
Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.
Abstract
תרבית תאים חד שכבתי כראוי אינו מודל ההתנהגות in vivo של רקמות, אשר כרוך אינטראקציות תאים תאים ותא-מטריצה מורכבת. תלת ממדי (3D) תא טכניקות תרבות הם חידוש אחרון פותח כדי לענות על החסרונות של תרבית תאים חסידה. בעוד מספר טכניקות ליצירת אנלוגים רקמות במבחנה פותחו, שיטות אלה הן מורכבים לעתים קרובות, יקרים להקים, דורשות ציוד מיוחד, והם מוגבלים בדרך כלל על ידי תאימות עם סוגי תאים מסוימים בלבד. כאן אנו מתארים פרוטוקול מהיר וגמיש לאיסוף תאים לתוך spheroids 3D רב-תאיים של גודל עקבי תואמת צמיחה של מגוון רחב של גידולי שורות תאים נורמלים. אנו מנצלים ריכוזים שונים של תאית בסרום מתיל (MC) לקדם דור אליפטית-עצמאית למעגן ולמנוע היווצרות של monolayers התא באופן מאוד לשחזור. תנאים אופטימליים indivשורות תאים idual יכולה להיות מושגת על ידי התאמת MC או ריכוזים בסרום בטווח הבינוני היווצרות אליפטית. הספרואידים 3D שנוצרו ניתן לאסוף לשימוש במגוון רחב של יישומים, כולל איתות תא או ביטוי במחקרי גן, הקרנת סמים מועמדת, או בחקר תהליכים תאיים כגון פלישת תאים סרטניים והגירה. הפרוטוקול גם להתאים בקלות ליצור spheroids המשובט מתאים יחידים, והוא יכול להיות מותאם על מנת להעריך צמיחה למעגן-עצמאי-התנגדות anoikis. בסך הכל, הפרוטוקול שלנו מספק שיטה וניתנת לשינוי להפקה וניצול spheroids תאי 3D כדי לשחזר את המיקרו-סביבת 3D של רקמות מודל צמיחת vivo של תאים נורמלים גידולים.
Introduction
ביולוגית רלוונטית הערכת התנהגות תאים הסרטניים היא מאתגר באמצעות דו ממדים מסורתיות (2D) מתודולוגיות תרבית תאים, בין שאר משום אלה אינם משקפים באופן נאות את המיקרו-הסביבה הניידת שנמצאה in vivo. גישות חלופיות שילוב רכיבים תאים מטריקס לתוך התרבות (למשל, מבחנים קאמריים בוידן) מייצגות פיסיולוגי יותר של סביבת רקמות in vivo. עם זאת, הם יכולים להיות מוגבלים הערכת התנהגות תאים בודדת, ואינו לשחזר את המורכבות בצירופי vivo של אינטראקציות התא-מטריקס תאי תאים תורמים לצמיחת רקמות או גידול 1, 2, 3.
שימוש spheroids הרב התאי הוא גישה אחרונה יותר משחזרת את הארכיטקטורה הקומפקטית של צמיחת תאי vivo ב 1,4. Spheroids יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות תא-מטריצה של תאים נורמלים, אבל יכול לשמש גם אנלוגים גידול מודל מאפיינים של התקדמות גידול, כגון צמיחה גרורתי או סמי התנגדות 4.
Spheroids עלול להיוצר על ידי ההתפשטות של תאים בודדים משוקעים בתוך גוש 5, או יותר במהירות, על ידי קידום הצבירה של מספר תאים כדי ליצור אשכול תא בודד (למשל, ירידה תלויה, שיטות צנטריפוגה) 6, 7. טכניקות צבירת תא קיימות מסוימות עשויות לדרוש חומרים יקרים או ציוד מיוחד. בנוסף, יש spheroids אלה מגוון רחב של גדלי מורפולוגיות ועלול להיות קשה לייצר בכמויות גדולות, לערוך השוואות בין תנאי גידול או טיפולים קשים. לבסוף, spheroids המיוצרים בשיטות אלה יכול להיות קשה לבודד מן extracel חלבונייםמטריקס lular שבה הם משובצים לשימוש ביישומים אחרים.
כאן אנו מתארים מתודולוגיה צבירת תא חזקה ובקלות לשינוי להיווצרות של spheroids תא בגודל העקבי באמצעות זמינים מסחריים U-תחתונות צלחות תא-דוחה מטריצת קידום הידבקות אינרטי, תאי מתיל. מרגע היווצרותם, spheroids רב-תאיים אלה מבודדים בקלות לשימוש במגוון רחב של יישומים. הפרוטוקול גם להתאים בקלות ליצור spheroids באמצעות שגשוג תאים, אשר ניתן להשתמש כדי להעריך תהליכי תאים אחרים. כאן, אנו מציגים מבחני פלישת תא, לכמת ידי מכתים immunofluorescence, וכן assay anoikis, כמו יישומים לדוגמא של שני אלה פרוטוקולי היווצרות אליפטית שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מציגים שיטה מהירה וגמישה להפקת spheroids תאי 3D מודל הארכיטקטורה של רקמות in vivo באמצעות ריאגנטים זול וזמין באופן נרחב. הפרוטוקול שלנו מנצל את המאפיינים הלא-ציטוטוקסיות וקידום-הידבקות של 8 MC, 9 לתווך צבירת תא ולמזער היווצרות monolayer התא….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank M. Gordon of the Queen’s University Biomedical Imaging Centre for assistance. This work was supported by operating grants from the Cancer Research Society of Canada (19439) and the Canadian Institutes for Health Research (MOP-142303) (LMM), and by Ontario Graduate Scholarships and studentships from the Terry Fox Research Institute Training Program in Transdisciplinary Cancer Research (SMM, EYL), and by a Craig Jury Summer Studentship (SMM).
Materials
| Buffers | |||
| 10x Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Calcium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 21114 | Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of calcium chloride |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | M1028 | Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of magnesium chloride |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Spheroid Formation | |||
| 96-well U-bottom Cell-Repellent Plate | Greiner Bio-One | 650970 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | D5546 | For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines |
| F12K Medium | Thermo Fisher Scientific | 2112722 | For culturing TT cell line |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | Filter prior to use to remove particulate contaminants |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M7027 | Prepare in water to 100 mg/mL |
| Roswell Park Memorial Institute Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | Dissociation buffer |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Invasion Assay | |||
| Bovine Type I Collagen | Corning Incorporated | 354231 | Stock 3.1mg/ml; Maintain on ice when in use |
| DMEM Phenol Red Free Low Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11054-20 | Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium |
| Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | Chemoattractant |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Immunofluorescence Microscopy | |||
| #1.5 Coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72225-01 | For mounting excised spheroids |
| Alexa-Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Used to stain actin at 1:200 |
| Bovine Serum Albumin | Bioshop Canada Incorporated | ALB001 | Used in BSA blocking buffer |
| Dabco 33-LV | Sigma-Aldrich | 290734 | Antifade |
| Glycerol | Bioshop Canada Incorporated | GLY001 | Used in MOWIOL mounting medium |
| ImageJ Software | Freeware, NIH | – | Used for image analysis |
| Microslides | VWR International | 48312-024 | For mounting excised spheroids |
| MOWIOL 4-88 | EMD-Millipore | 475904 | Used in MOWIOL mounting medium |
| Paraformaldehyde | EMD-Millipore | PX0055-3 | Used in fixation buffer |
| Triton X-100 | Bioshop Canada Incorporated | TRX777 | Used in permeabilization buffer |
Referências
- Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays. Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).
- Albini, A., Noonan, D. M. The ‘chemoinvasion’ assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).
- Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. Methods Mol Biol. 695, 17-39 (2011).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. (51), (2011).
- Handschel, J. G., et al. Prospects of micromass culture technology in tissue engineering. Head Face Med. 3, 4 (2007).
- Stuckhoff, A. P., DelValle, L., Amini, S., White, M. K. . Neuronal Cell Culture Methods and Protocols Vol. 1078 Methods in Molecular Biology. 1078, 119-132 (2013).
- Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension. Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29 (2012).
- Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Anal. Biochem. 437 (1), 17-19 (2013).
