Um Método celular agregação eficiente e flexível para 3D Spheroid Produção

Summary

Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.

Abstract

Cultura de células em monocamada não modelar adequadamente o comportamento in vivo de tecidos, que envolve complexas interacções célula-célula e célula-matriz. Tridimensionais técnicas de cultura de células (3D) são uma inovação recente desenvolvido para resolver as deficiências da cultura de células aderentes. Embora várias técnicas para a produção de análogos de tecidos in vitro, têm sido desenvolvidos, estes métodos são muitas vezes complexos, caros para estabelecer, requer equipamento especializado, e são geralmente limitados pela compatibilidade com apenas certos tipos de células. Aqui, nós descrevemos um protocolo rápido e flexível para a agregação de células em esferóides multicelulares 3D de tamanho consistente, que é compatível com o crescimento de uma variedade de linhas celulares tumorais e normais. Nós utilizamos concentrações variáveis ​​de soro e metil celulose (MC) para promover a geração de esferóide independente de ancoragem e prevenir a formação de monocamadas de células de um modo altamente reprodutível. As condições óptimas para indivlinhas celulares idual pode ser conseguido ajustando MC ou concentrações de soro no meio de formação de esferóides. Os esferóides 3D gerados pode ser recolhido para uso em uma grande variedade de aplicações, incluindo a sinalização celular ou estudos de expressão de genes, o rastreio de fármacos candidato, ou no estudo de processos celulares, tais como invasão celular tumoral e a migração. O protocolo também é facilmente adaptada para gerar esferóides clonais de células isoladas, e podem ser adaptados para avaliar o crescimento independente de ancoragem e anoikis-resistência. Em geral, o nosso protocolo fornece um método facilmente modificável para a geração e utilização de esferóides de células 3D, a fim de recapitular o microambiente 3D de tecidos e modelar o crescimento in vivo de células normais e tumorais.

Introduction

Avaliação biologicamente relevante do comportamento das células tumorais é um desafio utilizando metodologias tradicionais de cultura de células de duas dimensões (2D), em parte porque estes não reflectem adequadamente o microambiente celular encontrado in vivo. Abordagens alternativas que incorporam os componentes da matriz extracelular em cultura (por exemplo, ensaios de câmara de Boyden) são representativos fisiologicamente mais do ambiente de tecido in vivo. No entanto, eles podem ser limitados a avaliação do comportamento de células individuais, e não recapitular o complexo in vivo em combinações de interacções célula-matriz e célula-célula que contribuem para o crescimento de tecido de tumor ou ^{1, 2, 3.}

O uso de esferóides multicelulares é uma abordagem recente que reproduz de forma mais precisa a arquitectura compacta de crescimento celular in vivo em ^1,4. Os esferóides podem ser utilizados para investigar interacções célula-matriz de células normais, mas também podem actuar como análogos de tumor para modelar as características de progressão tumoral, tais como o crescimento metastático ou resistência a drogas ^4.

Os esferóides podem ser formados pela proliferação de células individuais embebidas numa matriz de ^5, ou mais rapidamente, através da promoção da agregação de várias células de modo a formar um conjunto único de células (por exemplo, gota em suspensão, os métodos de centrifugação) ^{6, 7.} técnicas de agregação de células existentes pode exigir materiais caros ou equipamento especializado. Além disso, estes esferóides possuem uma vasta gama de tamanhos e morfologias e pode ser difícil de produzir em grandes quantidades, tornando a comparação entre condições de crescimento ou tratamentos difíceis. Finalmente, esferóides gerados por estes métodos podem ser difíceis de isolar a partir do extracel proteicolular matriz em que se encontram inseridas para utilização em outras aplicações.

Aqui, nós descrevemos um método de agregação celular robusta e facilmente controlável para a rápida formação de esferóides de células dimensionados de forma consistente utilizando placas disponíveis comercialmente de fundo em U de células-repelente e uma matriz de promoção de adesão inerte, celulose de metilo. Uma vez formados, estes esferóides multicelulares são prontamente isolados para utilização numa vasta gama de aplicações. O protocolo também é facilmente adaptada para gerar esferóides através da proliferação de células, o que pode ser utilizado para avaliar outros processos celulares. Aqui, mostramos ensaios de invasão celular, quantificados pela técnica de imunofluorescência, e um ensaio anoikis, como exemplos de aplicações destes dois protocolos de formação esferóide diferentes.

Protocol

Nota: Todos os reagentes e consumíveis estão listados na Lista de Materiais. 1. Produção Spheroid por agregação celular Solução de metil-celulose: preparar 100 ml de 100 mg / ml de celulose de metilo. Calor 50 mL ultrapura H2O a 80 ° C. Adicionar 10 g de pó de metil-celulose e agite até que as partículas são uniformemente dispersos. Levar o volume final com ultrapura frio H2O e agita-se a 4 ° …

Representative Results

Nós descrevemos um método flexível e eficiente para gerar esferóides discretos utilizando placas de células-repelentes e meios de formação de esferóides suplementadas com MC. Sob as condições apropriadas de MC e de soro, as células individuais assentar e aderir em conjunto no centro do poço para formar esferóides com adesão mínima para o fundo do poço. Usando este protocolo, esferóides foram gerados a partir de uma variedade de linhas celulares (Figura 2B).</stro…

Discussion

Apresenta-se um método rápido e flexível para a produção de esferóides de células 3D para modelar a arquitectura dos tecidos in vivo, utilizando reagentes baratos e amplamente disponíveis. Nosso protocolo explora as propriedades não-citotóxico e de promoção de adesão de MC ^{8, 9} para mediar a agregação celular e minimizar a formação de monocamada de células. Ao contrário de matrizes à base de proteínas isoladas a partir de fontes ani…

Materials

Buffers
10x Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	AM9625
Calcium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	21114	Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of calcium chloride
Magnesium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	M1028	Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of magnesium chloride
Name	Company	Catalog number	Comments
For Spheroid Formation
96-well U-bottom Cell-Repellent Plate	Greiner Bio-One	650970
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma-Aldrich	D5546	For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines
F12K Medium	Thermo Fisher Scientific	2112722	For culturing TT cell line
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F1051	Filter prior to use to remove particulate contaminants
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M7027	Prepare in water to 100 mg/mL
Roswell Park Memorial Institute Medium	Sigma-Aldrich	R8758	For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific	12605028	Dissociation buffer
Name	Company	Catalog number	Comments
For Invasion Assay
Bovine Type I Collagen	Corning Incorporated	354231	Stock 3.1mg/ml; Maintain on ice when in use
DMEM Phenol Red Free Low Glucose	Thermo Fisher Scientific	11054-20	Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium
Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor	Peprotech	450-10	Chemoattractant
Name	Company	Catalog number	Comments
For Immunofluorescence Microscopy
#1.5 Coverglass	Electron Microscopy Sciences	72225-01	For mounting excised spheroids
Alexa-Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Used to stain actin at 1:200
Bovine Serum Albumin	Bioshop Canada Incorporated	ALB001	Used in BSA blocking buffer
Dabco 33-LV	Sigma-Aldrich	290734	Antifade
Glycerol	Bioshop Canada Incorporated	GLY001	Used in MOWIOL mounting medium
ImageJ Software	Freeware, NIH	–	Used for image analysis
Microslides	VWR International	48312-024	For mounting excised spheroids
MOWIOL 4-88	EMD-Millipore	475904	Used in MOWIOL mounting medium
Paraformaldehyde	EMD-Millipore	PX0055-3	Used in fixation buffer
Triton X-100	Bioshop Canada Incorporated	TRX777	Used in permeabilization buffer