Un método de agregación celular eficiente y flexible para esferoide 3D Producción

Summary

Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.

Abstract

Cultivo de células en monocapa no modela adecuadamente el comportamiento in vivo de los tejidos, que implica interacciones célula-célula y célula-matriz complejos. Tridimensionales técnicas de cultivo celular (3D) son una innovación reciente desarrollado para hacer frente a las deficiencias de cultivo de células adherentes. Aunque se han desarrollado varias técnicas para la generación de análogos de tejidos in vitro, estos métodos son frecuentemente complejos, caros de establecer, requieren un equipo especializado, y en general están limitados por la compatibilidad con sólo ciertos tipos de células. Aquí, se describe un protocolo rápido y flexible para la agregación de células en esferoides multicelulares 3D de tamaño consistente, que es compatible con el crecimiento de una variedad de líneas celulares tumorales y normales. Utilizamos concentraciones variables de suero y metilcelulosa (MC) para promover la generación esferoide independiente de anclaje y evitar la formación de monocapas de células de una manera altamente reproducible. Las condiciones óptimas para Indivlíneas celulares idual se pueden lograr mediante el ajuste de las concentraciones séricas de MC o en el medio de la formación de esferoides. Los esferoides 3D generados pueden ser recogidos para su uso en una amplia gama de aplicaciones, incluyendo la señalización celular o estudios de expresión génica, la detección de drogas candidato, o en el estudio de los procesos celulares, tales como la invasión de células tumorales y la migración. El protocolo también se adapta fácilmente para generar esferoides clonales de células individuales, y se puede adaptar para evaluar el crecimiento independiente de anclaje y anoikis resistencia. En general, el protocolo proporciona un método fácilmente modificable para la generación y utilización de esferoides de células en 3D con el fin de recapitular el microambiente 3D de los tejidos y modelar el crecimiento in vivo de las células normales y tumorales.

Introduction

Evaluación biológicamente relevantes del comportamiento de las células tumorales es un reto utilizando metodologías tradicionales de cultivo de células de dos dimensiones (2D), en parte debido a que estos no reflejan adecuadamente el microambiente celular encontrado in vivo. Los enfoques alternativos que incorporan componentes de la matriz extracelular en la cultura (por ejemplo, ensayos de cámara de Boyden) son fisiológicamente más representativa de las condiciones del tejido in vivo. Sin embargo, pueden estar limitados a la evaluación de comportamiento de la célula individual, y no recapitulan el complejo pt combinaciones in vivo de célula-matriz y célula-célula interacciones que contribuyen a tejido o tumor de crecimiento ^{1, 2, 3.}

El uso de esferoides multicelulares es un enfoque reciente que reproduce con mayor precisión la arquitectura compacta de crecimiento in vivo de células ^1,4. Los esferoides se pueden utilizar para investigar las interacciones célula-matriz de las células normales, pero también pueden actuar como análogos tumorales para modelar características de la progresión del tumor, como el crecimiento metastásico o resistencia a los medicamentos ^4.

Los esferoides pueden formarse por la proliferación de células individuales embebidos en una matriz de ^5, o más rápidamente, mediante la promoción de la agregación de múltiples células para formar un clúster sola célula (por ejemplo, gota colgante, métodos de centrifugación) ^{6, 7.} técnicas de agregación de células existentes pueden requerir materiales costosos o equipo especializado. Además, estos esferoides tienen una amplia gama de tamaños y morfologías y pueden ser difíciles de producir en grandes cantidades, haciendo las comparaciones entre las condiciones de crecimiento o tratamientos difíciles. Finalmente, esferoides generados por estos métodos pueden ser difíciles de aislar de la extracel proteináceolular matriz en la que están inmersos para su uso en otras aplicaciones.

A continuación, se describe un método de agregación celular robusto y fácilmente modificable para la rápida formación de esferoides de células de tamaño constantemente utilizando placas disponibles comercialmente de fondo en U de células repelente y una matriz inerte que promueve la adhesión, metil celulosa. Una vez formados, estos esferoides multicelulares son fácilmente aislados para su uso en una amplia gama de aplicaciones. El protocolo también se adapta fácilmente para generar esferoides a través de la proliferación celular, que puede utilizarse para evaluar otros procesos celulares. Aquí, se muestra ensayos de invasión celular, cuantificados mediante tinción de inmunofluorescencia, y un ensayo de anoikis, como ejemplo, las aplicaciones de estos dos protocolos diferentes de formación de esferoides.

Protocol

NOTA: Todos los reactivos y consumibles se enumeran en la Lista de materiales. 1. Producción del esferoide por agregación de células Solución de metilcelulosa: Preparar 100 ml de 100 mg / ml de metilcelulosa. Calor 50 ml de H2O ultrapura a 80 ° C. Añadir 10 g de polvo de metilcelulosa y agitar hasta que las partículas se dispersan de manera uniforme. Llevar al volumen final con ultrapura fría …

Representative Results

Se describe un método flexible y eficiente para generar esferoides discretos utilizando placas de células repelentes y medios de formación de esferoides suplementado con MC. Bajo las condiciones apropiadas de MC y el suero, las células individuales se depositan y se adhieren juntos en el centro del pozo para formar esferoides con adhesión mínima a la parte inferior también. Usando este protocolo, esferoides se generan a partir de una variedad de líneas de células (Figura…

Discussion

Presentamos un método rápido y flexible para la producción de esferoides de células 3D para modelar la arquitectura de los tejidos in vivo usando reactivos baratos y ampliamente disponibles. Nuestro protocolo explota las propiedades no citotóxicas y promotores de la adhesión de MC ^{8, 9} para mediar en la agregación de células y minimizar la formación de monocapa celular. A diferencia de matrices a base de proteínas aisladas a partir de fuentes …

Materials

Buffers
10x Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	AM9625
Calcium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	21114	Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of calcium chloride
Magnesium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	M1028	Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of magnesium chloride
Name	Company	Catalog number	Comments
For Spheroid Formation
96-well U-bottom Cell-Repellent Plate	Greiner Bio-One	650970
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma-Aldrich	D5546	For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines
F12K Medium	Thermo Fisher Scientific	2112722	For culturing TT cell line
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F1051	Filter prior to use to remove particulate contaminants
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M7027	Prepare in water to 100 mg/mL
Roswell Park Memorial Institute Medium	Sigma-Aldrich	R8758	For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific	12605028	Dissociation buffer
Name	Company	Catalog number	Comments
For Invasion Assay
Bovine Type I Collagen	Corning Incorporated	354231	Stock 3.1mg/ml; Maintain on ice when in use
DMEM Phenol Red Free Low Glucose	Thermo Fisher Scientific	11054-20	Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium
Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor	Peprotech	450-10	Chemoattractant
Name	Company	Catalog number	Comments
For Immunofluorescence Microscopy
#1.5 Coverglass	Electron Microscopy Sciences	72225-01	For mounting excised spheroids
Alexa-Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Used to stain actin at 1:200
Bovine Serum Albumin	Bioshop Canada Incorporated	ALB001	Used in BSA blocking buffer
Dabco 33-LV	Sigma-Aldrich	290734	Antifade
Glycerol	Bioshop Canada Incorporated	GLY001	Used in MOWIOL mounting medium
ImageJ Software	Freeware, NIH	–	Used for image analysis
Microslides	VWR International	48312-024	For mounting excised spheroids
MOWIOL 4-88	EMD-Millipore	475904	Used in MOWIOL mounting medium
Paraformaldehyde	EMD-Millipore	PX0055-3	Used in fixation buffer
Triton X-100	Bioshop Canada Incorporated	TRX777	Used in permeabilization buffer