Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.
Monolager cellodling inte tillräckligt modellera beteendet in vivo av vävnader, vilket inbegriper komplicerade cell-cell och cell-matrix-interaktioner. Tredimensionella (3D) cellodlingstekniker är en ny innovation utvecklats för att åtgärda bristerna i vidhäftande cellkultur. Medan flera tekniker för att generera vävnads analoger in vitro har utvecklats, dessa metoder är ofta komplexa, dyra att upprätta, kräver specialiserad utrustning och är i allmänhet begränsade av kompatibilitet med endast vissa celltyper. Här beskriver vi en snabb och flexibel protokoll för aggregering celler i flercelliga 3D sfäroider konsekvent storlek som är kompatibel med en tillväxt på en mängd olika tumör och normala cellinjer. Vi utnyttjar varierande koncentrationer av serum och metylcellulosa (MC) för att främja förankringsoberoende sfäroid generering och förhindra bildandet av cellmonoskikt på ett mycket reproducerbart sätt. Optimala förhållanden för individual cellinjer kan åstadkommas genom att justera MC eller serumkoncentrationerna i sfäroid formation mediet. 3D sfäroider som genereras kan samlas upp för användning i ett brett spektrum av tillämpningar, inklusive cellsignalering eller genuttryck studier, läkemedelskandidaten screening, eller i studier av cellulära processer såsom tumörcellinvasion och migration. Protokollet är också lätt anpassas för att generera klonala sfäroider från enstaka celler, och kan anpassas för att bedöma förankringsoberoende tillväxt och anoikis resistens. Sammantaget ger våra protokoll en lätt modifierbar metod för generering och användning av 3D-cell sfäroider för att rekapitulera 3D mikromiljö av vävnader och modellera tillväxten av normala celler och tumörceller in vivo.
Biologiskt relevant bedömning av tumörcellbeteende utmanar med traditionella tvådimensionella (2D) cellodlingsmetoder, delvis på grund av dessa inte korrekt speglar cellmikro påträffats in vivo. Alternativa metoder som innehåller extracellulära matrixkomponenter i kulturen (t.ex. Boyden kammaranalyser) är mer fysiologiskt representativ för in vivo vävnadsmiljö. Däremot kan de begränsas till bedömning av enskilda cellbeteende, och inte rekapitulera komplexet in vivo kombinationer av cell-matrix och cell-cell-interaktioner som bidrar till vävnad eller tumörtillväxt 1, 2, 3.
Användningen av flercelliga sfäroider är en ny metod som mer exakt återger den kompakta arkitektur in vivo celltillväxt 14. Sfäroider kan användas för att undersöka cell-matris interaktioner av normala celler, men kan också fungera som tumör analoger för att modellera egenskaper hos tumörprogression, såsom metastatisk tillväxt eller läkemedelsresistens 4.
Sfäroider kan bildas genom proliferationen av enskilda celler inbäddade i en matris 5, eller snabbare, för att genom att främja aggregering av flera celler bildar en enda cellkluster (t.ex., hängande droppe, centrifugeringsmetoder) 6, 7. Befintliga cell aggregering tekniker kan kräva kostsamma material eller specialutrustning. Dessutom är dessa sfäroider har ett brett utbud av storlekar och morfologier och kan vara svåra att producera i stora mängder, vilket gör jämförelser mellan tillväxtbetingelser eller behandlingar svåra. Slutligen kan sfäroider som genereras av dessa metoder vara svåra att isolera från det proteinhaltiga extracellular matris i vilken de är inbäddade för användning i andra tillämpningar.
Här beskriver vi en robust och lätt modifierbar cellaggregation metodik för snabb bildning av genomgående dimensionerade cell sfäroider användning av kommersiellt tillgängliga U-bottnade cellavvisande plattor och ett inert vidhäftningsbefrämjande matris, metylcellulosa. När den väl bildats, är dessa flercelliga sfäroider lätt isoleras för användning i ett brett spektrum av tillämpningar. Protokollet är också enkelt anpassas för att generera sfäroider genom cellproliferation, vilket kan användas för att utvärdera andra cellprocesser. Här visar vi cellinvasionsanalyser, kvantifierade genom immunofluorescens färgning, och en anoikis analys, som exempelvis tillämpningar av dessa två olika sfäroid formation protokoll.
Vi presenterar en snabb och flexibel metod för att producera 3D-cell sfäroiderna att modellera arkitektur in vivo vävnader med hjälp av billiga och lättillgängliga reagens. Vår protokoll utnyttjar icke-cytotoxiska och vidhäftningsbefrämjande egenskaperna hos MC 8, 9 att medla cell aggregering och minimera cellmonolager bildas. Till skillnad från proteinbaserade matriser som isolerats från djurkällor, är MC inert, innehåller inga tillväxtf…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank M. Gordon of the Queen’s University Biomedical Imaging Centre for assistance. This work was supported by operating grants from the Cancer Research Society of Canada (19439) and the Canadian Institutes for Health Research (MOP-142303) (LMM), and by Ontario Graduate Scholarships and studentships from the Terry Fox Research Institute Training Program in Transdisciplinary Cancer Research (SMM, EYL), and by a Craig Jury Summer Studentship (SMM).
Buffers | |||
10x Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
Calcium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 21114 | Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of calcium chloride |
Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | M1028 | Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of magnesium chloride |
Name | Company | Catalog number | Comments |
For Spheroid Formation | |||
96-well U-bottom Cell-Repellent Plate | Greiner Bio-One | 650970 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | D5546 | For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines |
F12K Medium | Thermo Fisher Scientific | 2112722 | For culturing TT cell line |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | Filter prior to use to remove particulate contaminants |
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M7027 | Prepare in water to 100 mg/mL |
Roswell Park Memorial Institute Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines |
TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | Dissociation buffer |
Name | Company | Catalog number | Comments |
For Invasion Assay | |||
Bovine Type I Collagen | Corning Incorporated | 354231 | Stock 3.1mg/ml; Maintain on ice when in use |
DMEM Phenol Red Free Low Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11054-20 | Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium |
Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | Chemoattractant |
Name | Company | Catalog number | Comments |
For Immunofluorescence Microscopy | |||
#1.5 Coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72225-01 | For mounting excised spheroids |
Alexa-Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Used to stain actin at 1:200 |
Bovine Serum Albumin | Bioshop Canada Incorporated | ALB001 | Used in BSA blocking buffer |
Dabco 33-LV | Sigma-Aldrich | 290734 | Antifade |
Glycerol | Bioshop Canada Incorporated | GLY001 | Used in MOWIOL mounting medium |
ImageJ Software | Freeware, NIH | – | Used for image analysis |
Microslides | VWR International | 48312-024 | For mounting excised spheroids |
MOWIOL 4-88 | EMD-Millipore | 475904 | Used in MOWIOL mounting medium |
Paraformaldehyde | EMD-Millipore | PX0055-3 | Used in fixation buffer |
Triton X-100 | Bioshop Canada Incorporated | TRX777 | Used in permeabilization buffer |