Small RNA Transfectie in primaire humane Th17 cellen door Next Generation Electroporation
Summary
Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.
Abstract
CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from naïve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1β, IL-6, IL-23, and TGFβ. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, RORγt, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.
Introduction
CD4 + T-cellen zijn cruciaal orchestrators van de adaptieve immuunrespons. Naïeve CD4 + T-cellen kunnen ontwikkelen in verschillende effector T-cellen (bijv Th1, Th2, Th17, enz.), Elk met hun eigen set van karakteristieke cytokinen en transcriptiefactoren, afhankelijk van de plaatselijke micromilieu 1. Het geslacht besluiten dat T-cellen vormen cruciaal zijn voor beschermend immuniteit en tolerantie voor zichzelf. Th17 cellen zijn een subgroep van T-cellen bekend extracellulaire bacteriën en schimmels te bestrijden, maar hun verkeerde reacties zijn ook betrokken bij de pathogenese van multiple autoimmuun- en ontstekingsziekten zoals multiple sclerose en psoriasis 2, 3. Th17 humane cellen kunnen worden gegenereerd uit naïeve CD4 + T-cellen in vitro door hen met een geschikte polariserende omgeving 4. Vario ons combinaties van de cytokines IL-1β, IL-23, TGF-P en IL-6 zijn gebruikt voor de ontwikkeling van de menselijke Th17 cellen. Menselijke Th17 cellen brengen CCR6, een chemokine receptor die gewoonlijk wordt gebruikt om deze celpopulatie en worden omschreven met hun belangrijkste transcriptiefactor RORγt (gecodeerd door RORC) 5, 6. Th17 cellen hebben de mogelijkheid om meerdere cytokinen tot expressie brengen, maar IL-17A is de lijn definiëren effector cytokine geproduceerd door deze cellen. Onderzochten we de expressie van alle drie Th17 geassocieerde markers (CCR6, RORγt, IL-17A) om de robuustheid van onze menselijke Th17 differentiatie in vitro assay te evalueren. Daarnaast hebben we gekweekte humane CD4 + -T-cellen onder niet-polariserende omstandigheden waarbij geen cytokinen of blokkerende antilichamen die aan het kweekmedium toegevoegd om als negatieve controle omdat expressie van deze markers Th17 laag of afwezig moeten zijn.
ve_content "> Een manier om normale humane T-celontwikkeling en biologie studie is om genexpressie te manipuleren tijdens de ontwikkeling. Korte interfererende RNA (siRNA) zijn synthetische kleine RNA moleculen die eiwitcoderende mRNA targeten en kan worden toegepast om genexpressie te verlagen . MicroRNAs (miRNA's) zijn endogene niet-coderende kleine RNAs bekend genexpressie posttranscriptioneel. miRNAs bleken een belangrijke rol in zowel muizen- als humane T-cel biologie spelen, met inbegrip van Th17 cellen 7, 8, 9. de is essentieel voor betrouwbare werkwijzen voor het manipuleren van kleine RNA in humane T-cellen hun effecten op genexpressie en uiteindelijk menselijke T-celbiologie bestuderen. we beschrijven hier een eenvoudig te gebruiken, consistent en betrouwbaar protocol dat we hebben ontwikkeld voor het inbrengen kleine synthetische RNAs en afgesloten nucleïnezuren (LNA's, chemisch gemodificeerde nucleïnezuren met verhoogde stabiliteit)in immuuncellen, en in het bijzonder in de menselijke Th17 cellen.Er zijn verscheidene alternatieve werkwijzen voor het inbrengen kleine RNA's in zoogdiercellen, die in het algemeen in chemische, biologische of fysische categorieën 10 vallen. Gewoonlijk gebruikte chemische werkwijzen, waaronder op lipiden gebaseerde transfecties en calciumfosfaat transfectie, afhankelijk maken van chemisch-DNA-complexen die efficiënter door cellen genomen. Over het algemeen chemische werkwijzen niet zo efficiënt voor de transfectie van primaire T-cellen. De meest voorkomende biologische methode is om een virale vector (bijvoorbeeld retrovirus of lentivirus), dat direct ingevoegd vreemde RNA in een gastheer als onderdeel van zijn natuurlijke replicatiecyclus gebruiken. Virale transductie duurt kenmerkend langer in beslag, vooral wanneer men factoren in de tijd voor moleculaire klonering van provirale plasmiden. Daarnaast kunnen virale vectoren transductie potentieel schadelijk voor de onderzoekers. Elektroporatie is een fysiek methode induceren membraan permeabilisatie door het onderwerpen van cellen aan hoogspanningspulsen, waarbij nucleïnezuren transiënt voeren in de cel waar ze inwerken op hun doel. Traditionele elektroporatie instrumenten waren niet effectief voor het transfecteren primaire lymfocyten. Toch is geoptimaliseerd next generation elektroporatie bewezen in staat T-cellen te transfecteren met zeer hoge efficiëntie, in het bijzonder wanneer het materiaal te transfecteren klein RNA. De term generatie losjes gebruikt om de twee nieuwere platforms (bijvoorbeeld neon, Amaxa) door traditionele elektroporatie machines differentiëren. Bovendien is deze werkwijze gemakkelijk schaalbaar voor matige doorvoer screenings met tot ongeveer 120 kleine RNAs in een enkel experiment, vaak met gevalideerde synthetische reagentia. Belangrijker is dat succesvolle transfecties worden bereikt in slechts 16 uur na T-celactivering. Het nadeel van deze methode is echter dat zij niet tot stabiele genomische incorporatiop, en is daarom van voorbijgaande aard. Daarom is de extra inspanning een stabiel expressieconstruct dat kan worden verpakt in een virale vector en met succes tot expressie gebracht in T-cellen wanneer langdurige expressie van een kleine RNA nodig maken waard.
We hebben een nieuwe generatie transfectie (bijvoorbeeld Neon) gebruikt om diverse synthetische enkel- of dubbelstrengs RNA of LNA oligonucleotide gereedschappen leveren voor verschillende doeleinden 11, 12, 13. Efficiënte RNA interferentie kan worden geïnduceerd in primaire muis en menselijke T-cellen met behulp van dubbelstrengs korte interfererende RNA (siRNA). Dit protocol beschrijft geoptimaliseerde omstandigheden voor het gebruik van deze techniek in humane cellen Th17. In aanvulling op siRNA, kunnen in de handel verkrijgbare synthetische miRNA bootst en remmers worden gebruikt om miRNA winst en verlies van functie te bestuderen. miRNA bootst dubbelstrengs RNA-moleculen, vergelijkbaar met siRNA, maar designed met de sequentie van endogeen mature miRNAs. miRNA-remmers worden chemisch gemodificeerde RNA en / of LNA gebaseerd enkelstrengs oligonucleotiden die binden aan natief miRNAs en hun functie antagoniseren. We hebben ontdekt dat elk van deze instrumenten effectief kan worden gebruikt in gekweekte primaire T-lymfocyten, met inbegrip van maar niet beperkt tot de menselijke Th17 cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol verschaft een verbeterde werkwijze voor het afleveren van kleine RNA's in humane cellen Th17. Hoewel menselijke cellen Th17 hier gebruikt, kan deze werkwijze elektroporatie van kleine RNA's worden gebruikt met andere primaire menselijke T-helper-subsets, zoals Th1, Th2 en Tregs. Het is niet goed gewerkt voor naïeve CD4 + T-cellen, zodat de cellen moeten worden geactiveerd in cultuur voorafgaand aan transfectie. Voor dit protocol, we eerst geoptimaliseerd in vitro kweeksysteem be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the US National Institutes of Health grants (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), a Leukemia & Lymphoma Society scholar award (K.M.A.), and the National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Medical Scientist Training Program (Grant #T32GM007618) (M.M.).
Materials
| anti-human IL-17A PE | ebioscience | 12-7179-42 | Clone: eBio64DEC17 |
| anti-human IFNg FITC | ebioscience | 11-7319-82 | Clone: 4S.B3 |
| anti-human CD4 eVolve605 | ebioscience | 83-0047-42 | Clone: SK3 |
| mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421 | BD biosciences | 562515 | Clone: 11A9 |
| anti-human RORgt AF647 | BD biosciences | 563620 | Clone: Q21-559 |
| anti-human CD45 eFluor450 | ebioscience | 48-9459-42 | Clone: 2D1 |
| Foxp3/Trascription Factor Staining Buffer Set | ebioscience | 00-5523-00 | For intracellular transcription factor flow cytometry staining |
| Hu FcR Binding Inhibitor Purified | ebioscience | 14-9161-71 | |
| ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium | Stemcell Technologies | 10981 | "Serum-Free Base Media" |
| MACS CD28 pure functional grade, human | Miltenyi Biotec | 130-093-375 | Clone: 15E8 |
| anti-human CD3 Purified | UCSF monoclonal antibody core | N/A | Clone: OKT-3 |
| LEAF purified anti-human IL-4 | Biolegend | 500815 | Clone: MP4-25D2 |
| anti-human IFNg, functional grade purified | ebioscience | 16-7318-85 | Clone: NIB42 |
| Recombinant human IL-23 | Peprotech | 200-23 | |
| Recombinant human IL-1β | Peprotech | 200-01B | |
| Recombinant human TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Recombinant human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| siGENOME Control Pool, Non-targeting #2 | Dharmacon | D-001206-14-05 | |
| siGENOME SMARTpool Human RORC | Dharmacon | M-003442-00 | |
| siGENOME SMARTpool Human PTPRC | Dharmacon | M-008067-01 | |
| Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | ThermoFisher Scientific | 11346D | Human CD4+ T cell Isolation Kit |
| Neon Tranfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Next generation electroporation instrument |
| Neon Tranfection System 10 μl Kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Resuspension Buffer T | ThermoFisher Scientific | Provided in kit (MPK1096) | "Transfection Resuspension Buffer" |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | #07801 | Density Gradient Medium |
| costar 6-well tissue culture treated plates | Corning | 3516 | flat bottom plates |
| costar 48-well tissue culture treated plates | Corning | 3548 | flat bottom plates |
| BD Pharm Lyse lysing buffer, 10 X | BD biosciences | 555899 | Must make 1X solution with distilled water prior to use |
References
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*. Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Ann Rev Immunol. 27 (1), 485-517 (2009).
- Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing. Nature. 14 (9), 585-600 (2014).
- Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. Properties and origin of human Th17 cells. Mol Immunol. 47 (1), 3-7 (2009).
- Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunol. 8 (6), 639-646 (2007).
- Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med. 204 (8), 1849-1861 (2007).
- Du, C., et al. MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis. Nature Immunol. 10 (12), 1252-1259 (2009).
- Escobar, T. M., et al. miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression. Immunity. 40 (6), 865-879 (2014).
- Wang, H., et al. Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210. Nature Immunol. 15 (4), 393-401 (2014).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal bioanal chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Steiner, D. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. 35 (2), 169-181 (2011).
- Simpson, L. J., et al. A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production. Nature Immunol. 15 (12), 1162-1170 (2014).
- Pua, H. H., et al. MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production. Immunity. 44 (4), 821-832 (2016).
- Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), (2015).
- Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), 10437-10442 (2015).
